【摘要】 目的 观察17β-雌二醇(E2) 对人精子快速的非基因组激活效应，并探讨其相关的作用机制。方法雌激素受体拮抗剂Tamoxifen (0.05μmol/L)预处理20min后，分别用E2 (1μmol/L)、雌二醇-牛血清白蛋白结合物（E2-BSA，5μmol/L）作用获能人精子15min，以三色法染色检测获能人精子顶体反应率，Western blotting检测丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)蛋白的表达变化。结果E2、E2-BSA均能提高人精子的顶体反应率和促进p42/p44磷酸化MAPK蛋白的表达，且两者的作用均可被Tamoxifen所阻断。结论人精子膜上可能存在膜雌激素受体(mER)，雌激素与mER结合后可通过MAPK信号途径快速激活人精子。
【关键词】 17β-雌二醇； 人精子；顶体反应；膜雌激素受体；丝裂原活化蛋白激酶
AbstractObjective To study the rapid non-genic effect and mechanism of 17β-estradiol on human spermatozoon activation.Methods Human spermatozoa were cultivated with E2(1μmol/L) or E2-BSA(5μmol/L) for 15 minutes after treated with tamoxifen(0.05μmol/L)for 20 minutes.Acrosome reaction rates were scored by trichrome staining and MAPK activity was determined by Western blotting.ResultsE2 or E2-BSA significantly increased the acrosome reaction rates and MAPK activity (p42/p44).The effects of E2 or E2-BSA were able to be inhibited by tamoxifen.ConclusionsThere may be some membrane estrogen receptors on the human spermatozoa，which mediate the rapid activational effects of estrogen on human spermatozoa through MAPK pathways.
KEYWORDShuman spermatozoonacrosome reactionmembrane estrogen receptormitogen-activated protein kinase
越来越多的研究资料证明，雌激素在精子的成熟及精子功能的获得中都起着非常重要的调节作用，体外环境下，雌激素对精子有一定的激活效应，在精子运动力的获得、精子蛋白的酪氨酸磷酸化、获能、顶体反应和受精等过程中有重要的促进作用［1］ 。但迄今为止，雌激素人精子激活作用的机制尚未完全阐明。为此，本实验用17β-雌二醇（E2）作用正常人获能精子，观察雌激素对人精子激活的指标之一顶体反应的影响，并探讨参与该过程的MAPK信号通路。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1主要试剂 17β-雌二醇（E2）、雌二醇-牛血清白蛋白复合物（E2-BSA）、牛血清白蛋白（BSA）、雌激素受体(ER)拮抗剂Tamoxifen均购自Sigma公司；兔抗p-44/42单克隆抗体购自Cell Signaling公司；化学发光增强剂购自New England Biolabs公司；台盼蓝购自Chroma公司；俾士麦棕Y购自美国Schmid GMBH公司；玫瑰红购自Fluka公司。
1.1.2精液标本采集实验所用33例精液标本来自年龄25~45岁﹑有正常生育史﹑身体健康的成年男性志愿者，其精液常规各项指标符合WHO制定的正常精液常规标准［2］。
1.1.3精子悬液制备供精者禁欲3~7d后手淫获取精液，将精液标本置于37℃孵箱（5％CO2）中40min，使其完全液化。用上游技术获取活动良好的精子，经BWW低蛋白液（含0.3%BSA）洗涤3次后，用BWW获能液（含3.5%BSA）调整精子密度至20×109/L，在孵箱中孵育4h使精子获能。
1.2方法
1.2.1三色法检测精子顶体反应（AR）率经各实验因素处理后，获能精子悬液与1%的台盼蓝以体积比3：1混合，37℃孵育20min，离心、无蛋白BWW液洗涤2次，涂片、室温干燥，75%乙醇固定30min，双蒸水冲洗、俾士麦棕Y染色、玫瑰红复染，最后用85%，95% 和100%的乙醇逐级脱水、二甲苯透明，树脂封片后观察。每张涂片在油镜下计数200个精子，计算AR率。
1.2.2Western blotting检测精子磷酸化MAPK蛋白（p42/p44）表达精子经实验因素处理后进行离心、裂解，用BCA法测定精子蛋白浓度［3］。所得蛋白提取液进行SDS-PAGE电泳，以湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，封闭1h后，加入一抗体（抗p42/p44磷酸化单克隆抗体，1:3000）室温孵育1h，PBST洗膜3次，之后加入二抗（HRP标记羊抗鼠IgG，1:5000）室温孵育1h，PBST洗膜3次，与ECL发光底物反应2min，X光片曝光、显影定影。用抗人肌动蛋白抗体β-action作为内参照，进行二次免疫印迹。用图像处理系统对X光片进行扫描测定感光区带的灰度值，以p42/p44蛋白条带与β-action条带的比值表示磷酸化p42/p44 MAPK蛋白的表达量。
1.2.3统计学处理实验数据均以±s表示，利用SPSS11.5统计学软件进行方差分析，P＜0.05被认为有统计学意义。
2结果
2.1E2、E2-BSA对人精子AR率的影响结果如表1所示。与空白对照组相比，E2（1μmol/L）、E2-BSA（5μmol/L）作用15min后，精子顶体反应率均明显提高（P＜0.05），且两作用组间无显著差异(P＞0.05)；Tamoxifen（0.05μmol/L）预处理精子20min后，E2（1μmol/L）、E2-BSA（5μmol/L）诱导的精子顶体反应率明显受到抑制，且显著低于E2（1μmol/L）、E2-BSA（1μmol/L）单纯诱导的精子顶体反应率；Tamoxifen（0.05μmol/L）单纯作用组对精子顶体反应率无明显影响（P＞0.05）。表1Tamoxifen对E2、E2-BSA诱导精子顶体反应率的影响（略）注：* P＜0.05 vs control，# P＜0.05 vs E2，▲ P＜0.05 vs E2-BSA
2.2E2、E2-BSA对人精子p42/p44磷酸化MAPK蛋白表达的影响
本实验以磷酸化p42/p44 MAPK蛋白与内参照肌动蛋白β-actin条带的灰度值比值表示MAPK活性的变化，图1为Western blotting检测结果。各组磷酸化p42/p44 MAPK蛋白表达量分别为：对照组（0.7025±0.1471、0.7446±0.1559），E2（1μmol/L）单独作用组（0.8295±0.1936、0.9799±0.2052），E2-BSA（5μmol/L）单独作用组（0.7993±0.1568、0.9532±0.1662），Tamoxifen（0.05μmol/L）+ E2（1μmol/L）作用组（0.6995±0.1402、0.7344±0.1472），Tamoxifen（0.05μmol/L）+ E2-BSA（5μmol/L）作用组（0.6739±0.1347、0.7076±0.1418），Tamoxifen（0.05μmol/L）单独作用组（0.7003±0.1420、0.7353±0.1496）。统计分析显示，E2（1μmol/L）、E2-BSA（5μmol/L）作用获能精子15min后，均可显著增加精子内p42/p44磷酸化MAPK蛋白的表达（P＜0.05，P＜0.01)。用雌激素受体拮抗剂Tamoxifen预处理人精子20min后，可明显抑制E2、E2-BSA的作用（P＜0.05，P＜0.01)。Tamoxifen单独作用对p42/p44磷酸化MAPK蛋白表达无明显影响(P＞0.05)。
3讨论
雌激素的非基因组效应（即不经过DNA转录、mRNA生成、蛋白质合成过程的快速效应）是近年来的研究热点之一。在雌激素对雄性动物生殖功能影响的研究中，也发现了非基因组效应的存在，在短时间内雌激素就可实现相应的调节作用［4］。精子激活的最终结果表现为顶体反应，是决定精子受精能力的重要前提。
已有研究发现，高活性的雌激素物质17β-雌二醇（E2）可提高人精子的顶体反应率［5］，但目前E2促进精子发生顶体反应的具体机制还未阐明。在本实验中，我们用E2短时间（15min）作用获能人精子后，精子的AR率明显提高。成熟人精子的DNA呈高度凝聚状态，几乎没有蛋白的合成，因此，E2对人精子的激活作用可能不依赖基因转录，而是一种快速的非基因效应。为探讨E2快速诱导精子发生顶体反应是否借助于膜信号途径来实现，我们用非透膜性大分子物质E2-BSA作用人精子相同时间，发现E2-BSA亦可明显提高精子的顶体反应率且与E2的作用相似。E2-BSA是一种雌激素大分子复合物，其中不含游离的雌二醇，该物质不能透过细胞膜发挥作用，因此，我们推测雌激素可能借助于某些膜信号途径参与的非基因组效应快速激活精子。Baldi等人用免疫沉淀和Western Blot 的方法检测到在人精子膜上存在一种蛋白，可能是雌激素的一种非基因组型受体，其分子量只有29kDa，小于经典的核ERα和ERβ［6］。国内外研究报道及本实验的研究结果均证明成熟人精子膜上可能存在雌激素受体（mER），雌激素与mER相互作用后可快速诱导精子发生顶体反应。目前，人精子mER的分子结构尚未阐明，本实验中，我们用核雌激素受体拮抗剂Tamoxifen预处理人精子后，发现Tamoxifen可明显抑制E2、E2-BSA快速诱导精子发生顶体反应的作用，这提示人精子的mER与传统核ER在结构上可能存在有相近之处。
为进一步探讨雌激素通过mER快速激活精子的膜信号转导途径，我们观察了MAPK信号途径在其中的作用。MAPK为多种细胞外信号（激素、神经递质、细胞因子和生长因子等）从细胞表面受体传向细胞内的一条重要信号转导通路。本研究发现，E2、E2-BSA作用于人精子15 min，p42/p44磷酸化MAPK蛋白含量明显增多，使用雌激素受体拮抗剂Tamoxifen预处理后可抑制E2的作用。以上结果表明，雌激素快速诱导精子发生顶体反应的作用可能是通过MAPK信号转导途径实现的。
有关雌激素快速引起生物效应的跨膜信号通路，目前有多种解释，包括PKA、PKC、PKG、一氧化氮合酶和PI3-Kinase-Akt等，其中G蛋白偶联的受体信号通路可能是较重要的途径之一［7］。有报道证明，E2作用于mER后可通过G蛋白作用进而激活PKC，亦可快速升高细胞内cAMP水平，引起胞外钙离子内流和胞内蛋白的酪氨酸磷酸化［8］，Lamirande等认为MAPK信号通路参与了人精子的成熟、获能和顶体反应的过程，使用MAPK激酶的特异性抑制剂可导致使精子顶体反应率和精子蛋白的酪氨酸磷酸化水平降低［9］，因此我们推测E2有可能通过PKC、钙离子、酪氨酸激酶等信号途径激活MAPK。另外，E2的快速激活作用也可由和PI3-kinase-Akt信号通路所介导［10］，在这个过程中，MAPK信号转导通路与PI3-kinase-Akt信号通路之间是否存在关联目前尚不清楚。
综上所述，雌激素可借助于膜雌激素受体快速激活人精子，MAPK相关的信号转导通路可能参与了此过程，这为进一步阐明雌激素影响精子功能的作用机制提供了一定实验依据。
参考文献
［１］Rochira V，Granata AR，Madeo B，et al.Estrogens in males: what have we learned in the last 10 years［J］. Asian J Androl.2005;7(1):3-20.
［2］World Health Organization.WHO laboratory manual for the exanlination of human sperm and sperm -cervical mucus interaction ［M］.4th ed.New York: Cambridge University Press，2001.
［3］汪家政，范明.蛋白质技术手册［M］.科学出版社，2000:51-54.
［4］Michaela Luconi，Gianni Forti，Elisabetta Baldi.Genomic and nongenomic effects of estrogens: molecular mechanisms of action and clinical implications for male reproduction［J］.Journal of Steroid Biochemistry && Molecular Biology，2002:369-381.
［5］Adeoya-Osiguwa SA，Markoulaki S，Pocock V，et al.17beta-Estradiol and environmental estrogens ignificantly affect mammalian sperm function［J］.Hum Reprod.2003，18(1):100-107.
［6］M.Luconi，F.Francavilla，I.Porazzia，et al.Human spermatozoa as a model for studying membrane receptors mediating rapid nongenomic effects of progesterone and estrogens［J］.Steroids，2004:553-559.
［7］Thomas P，Pang Y，Filardo EJ，et al.Identity of an estrogen membrane receptor coupled to a G protein in human breast cancer cells［J］.Endocrinology，2005，146(2)：624-332．
［8］Jin W，Arai KY，Watanabe G，et al.The stimulatory role of estrogen on sperm motility in the male golden hamster (Mesocricetus auratus)［J］.J Androl，2005，26(4):478-484．
［9］E.de Lamirande，C.Gagnon.The extracellular signal-regulated kinase(ERK)pathwy is involved in human sperm function and modulated by the superoxide anion［J］.Molecular human reproduction，2002，8(2):124-135.
［10］Aquila S，Sisci D，Gentile M，Estrogen receptor (ER)alpha and ER beta are both expressed in human ejaculated spermatozoa: evidence of their direct interaction with phosphatidylinositol-3-OH kinase/Akt pathway［J］.J Clin Endocrinol Metab.2004， 89(3):1443-1451.