作者：戴红良 王洪新 吴国强 王东海
【摘要】 目的 研究左卡尼汀对h3O2引起的心肌细胞损伤的保护作用。方法 利用体外培养乳鼠心肌细胞，0.2 mM h3O2作用12 h建立氧化应激损伤模型，观察不同浓度左卡尼汀(50，100，200 mg/L)对心肌细胞活力、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响。结果 与正常组比较，模型组细胞活力下降，细胞MDA含量增加，SOD活性下降(P＜0.01)；与模型组比较，不同浓度的左卡尼汀可以提高心肌细胞活力，降低细胞MDA含量，增加SOD活性。结论 左卡尼汀对h3O2诱导的乳鼠心肌细胞损伤有保护作用。
【关键词】 左卡尼汀 过氧化氢 心肌细胞 损伤
左卡尼汀(L-carnitine， LC)，又名肉碱，广泛分布于体内不同组织细胞，作用是携带长链脂酰CoA通过线粒体内膜，促进三羟酸循环正常进行，协助细胞维持生理活动所需的能量生成。作为一种有效的氧自由基清除剂，左卡尼汀已成功地用于氧化应激损伤性心血管疾病的治疗，显示出其广阔的临床应用前景。本实验旨在通过利用h3O2对乳鼠心肌细胞造成氧化损伤，模拟心肌氧化应激损伤模型，直接从细胞水平上探讨左旋卡尼汀的上述心血管保护作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 出生1～3 d 的Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄兼用，由辽宁医学院实验动物中心提供。动物合格证号：SCXK(辽) 2003—0007。
1.1.2 主要药品和试剂 左卡尼汀，锦州奥鸿药业有限责任公司提供，用前溶于DMEM，配成所需浓度；过氧化氢，分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；胰蛋白酶(1：250)，Sigma公司；DMEM低糖培养基，Gibco公司；新生牛血清，杭州四季青生物科技有限公司；噻唑蓝(MTT)，Sigma公司； MDA、SOD试剂盒：南京建成生物工程研究所。
1.1.3 主要仪器 79—1磁力加热搅拌器，江南金坛电视大学应用电子厂；OLYMPUS倒置显微镜，日本；800型离心沉淀器，上海手术器械厂；恒温水浴振荡器，江苏金坛中大仪器厂；DG3022A型酶标仪，南京东华电子集团。
1.2 方法
1.2.1 原代心肌细胞培养 无菌操作下取出生1～3 d的SD乳鼠心脏，立即在PBS缓冲液中洗去残血，用眼科剪将心肌剪成约1 mm3 大小的碎块，放入50 mL三角烧瓶，加入0.08%胰蛋白酶消化液5 mL，在磁力搅拌器上(35～37 ℃)进行消化，10 min后取下吹打混匀后静置，吸弃上清，再加入5 mL胰蛋白酶消化液，同样消化8 min后，收集上清于离心管，并向离心管中加入少量DMEM培养基和小牛血清终止消化。上述过程反复进行5～6 次至组织块完全消化，200 目尼龙网过滤后离心收集细胞，重悬于含15％小牛血清的DMEM培养基，置入CO2 孵箱，37 ℃静置培养1.5 h，以差速贴壁法纯化心肌细胞，将未贴壁细胞调至密度约5×105/mL，0.4%台盼蓝染色，活细胞比率达90%以上，接种于培养板中。每24小时换液1次，培养48 h后见细胞融合后出现整体搏动，可进行实验。实验前24 h换以0.04%低血清培养[1]。
1.2.2 实验分组 将无血清培养24 h后的细胞分为5 组：①正常对照组：不加任何药物；②h3O2损伤组；③50 mg·L-1 LC保护组；④100 mg·L-1 LC保护组；⑤200 mg·L-1 LC保护组。损伤组在正常心肌细胞培养48 h后加入终浓度0.2 mmol·L-1的h3O2作用12 h；各保护组加入不同浓度的LC孵育1 h后，加入与损伤组相同的处理因素。
1.2.3 心肌细胞活力测定 采MTT比色法检测(设不加细胞只加孵育液的空白)检测细胞活力，将培养的心肌细胞以2.5×105/mL的密度接种于96 孔培养板，每孔200 μL。细胞分5 组，每组8孔，各组分别对应加入处理因素。于测试前4 h，每孔加入20 μL MTT(MTT终浓度0.5 mg·mL-1 )；于CO2孵箱中继续培养4 h后弃去培养液，每孔加入二甲基亚砜100 μL，震荡10 min，使结晶物充分溶解。选择570 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度（OD）值，可间接反映细胞活性的高低。
1.2.4 心肌细胞SOD、MDA的测定 将培养心肌细胞以5×105/mL，每孔1 mL的密度接种于24 孔培养板，按实验设计程序加入各种处理因素后收集细胞。参照试剂盒说明书，MDA采用硫代巴比妥显色法测定，SOD采用黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶法测定活性。
1.2.5 统计分析 数据均以x±s表示，应用SPSS 11.5软件包进行统计分析，采用方差分析及LSD-t检验进行统计学处理。
2 结 果
2.1 左卡尼汀对心肌细胞活性的影响 OD值大小可间接反映心肌细胞活力高低。分析数据可知h3O2组比正常对照组细胞活力降低，说明心肌细胞受到损伤；不同浓度左卡尼汀组较损伤组细胞活力增加，随浓度增加作用明显。说明左卡尼汀能保护h3O2损伤的心肌细胞，并有剂量依赖性，见图1。##P＜0.01VS对照组；*P＜0.05VS h3O2组；**P＜0.01VS h3O2组
图1 各个浓度左卡尼汀对过氧化氢(0.2 mmol/L)损伤乳鼠心肌肉细胞活力的影响(x±s， n=8 )2.2 左卡尼汀对细胞内MDA含量和SOD活性的影响 结果显示，与正常对照组比较，h3O2组MDA含量明显高于正常组，SOD活性明显低于正常组，不同浓度左卡尼汀组较损伤组MDA含量有所降低，SOD活性有所增加，并随浓度增加效果明显，见表1。表1 左卡尼汀对h3O2(0.2 mmol/L)损伤
3 讨 论
许多因素如炎症、化学试剂、辐射等都可能造成细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)增加。ROS大量堆积造成心肌细胞的凋亡和功能失调。在心肌缺血性损伤、心脏再灌注损伤及心力衰竭等心脏病变中，活性氧大量增加造成的病理反应可能参与了疾病的发生和进程[2，3]。h3O2是体内氧化代谢的产物。也是一类ROS，它不仅能直接氧化细胞膜上的脂质及蛋白，而且能自由穿过细胞膜和细胞内的铁离子反应生成·OH等活性更强的自由基，导致系列反应。因此，采用过氧化氢损伤模型可模拟多种心脏疾病的病理状态。
左卡尼汀它本身并不是机体的基本营养素，但却是脂肪酸进入线粒体进行β氧化所必需的辅助因子[4]。研究表明，左卡尼汀在以氧化应激为特征的各种心血管疾病的治疗中均显示出良好效果[5]，但其对心肌细胞氧化损伤的直接保护作用鲜有报道。本实验采用终浓度为0.2 mmol/L h3O2刺激心肌细胞12 h，导致心肌细胞氧化损伤。结果表明，预先加入不同剂量的左卡尼汀1 h后，与模型组比较，心肌细胞存活率和SOD活性明显上升，MDA生成量明显减少，表明左卡尼汀具有明显的抗氧化损伤的能力，并能提高自由基清除酶活性以及保护心肌细胞的完整性，从而有效维持抗氧化防御机制与自由基之间的平衡。结果提示左卡尼汀对h3O2损伤的心肌细胞有较好的保护作用。
综上所述，左卡尼汀对h3O2氧化损伤的心肌细胞均有明显的保护作用。其作用机制可能与其抗氧化酶类活性及抑制氧自由基对心肌细胞的损伤有关，其机理有待进一步深入研究。
参考文献
［1］ 吴国强，王洪新，荆黎. κ-阿片受体激动对异丙肾上腺素诱导的乳大鼠心肌细胞肥厚的抑制作用[J].中国药理学与毒理学杂志，2008，22(3):186-192.
［2］ Anversa P. Apoptosis and myocardial infarction[J]. Basic Res Cardial， 1998， 93(suppl 3):8-12.
［3］ Regula KM. Apoptosis of ventricular myocytes: a means to an end[J]. J Mol Cell Cardiac， 2005， 38(1):3-13.
［4］ Sakurabayashi T， Miyazaki S， Yuasa Y， et al. L-carnitine supplementation decreases the left ventricular mass in patients undergoing hemodialysis[J]. Circ J， 2008， 72(6):926-930.
［5］ Alvarez M， Mal cot CO， Gannier F， et al. Antimony-induced cardiomyopathy in guinea-pig and protection by L-carnitine [J]. Br J Pharmacol， 2005， 144(1):17-27.