作者：王志铭，刘欣，钱颖，雷振
【摘要】 目的 探讨间接CT淋巴造影(CTLG)定位和评价兔乳腺肿瘤及炎性病变前哨淋巴结(SLN)的可行性。方法 成年雌兔36 只，随机等分为3 组，1 组于右侧第2乳腺接种VX2肿瘤，1 组于右侧第2 乳腺注射鸡蛋黄乳胶，最后1组做空白对照。成模后，于每兔右侧第2乳腺注射碘普罗胺(370 mg/mL)1 mL并按摩30 s，分别于注射前及之后1、15、30、45、60 min进行CT扫描。其后，以亚甲蓝按相同方法注射，按摩30 s后解剖同侧腋窝，寻找蓝染淋巴结并进行病理检查。结果 所有动物右侧腋窝SLN明显强化，1 min时CT值达最高，为(106.24±28.26)Hu，其输入淋巴管全部显影。非SLN轻度强化，1 min时CT值为(59.43±11.62)Hu，输入淋巴管部分显影。形态上，肿瘤转移SLN明显增大，并可见对比剂充盈缺损;炎性反应性增生SLN体积增大，但对比剂充盈良好;正常SLN较小，对比剂充盈亦良好。采集1 min数据进行3D重建，可很好观察SLN形态及与其它结构关系。在MIP影像上测量SLN长、短径分别为：肿瘤组(10.33±2.63) mm、(7.50±1.82) mm;炎症组(8.09±1.64) mm、(4.72±0.53) mm;对照组(6.38±1.61) mm、(3.31±1.10) mm。统计学分析显示，肿瘤组SLN长、短径均显著大于对照组(P&<0.05);炎症组SLN与对照组比较，长、短径亦均显著大于后者(P&<0.05);肿瘤组SLN与炎症组相比，长、短径均显著大于后者(P&<0.05)。在CTLG过程中，邻近胸壁肌未见强化，邻近小静脉轻度强化。CTLG与亚甲蓝染色对比，SLN显示情况一致。结论 CTLG对于定位兔乳腺肿瘤及炎性病变所致的肿大SLN具有可行性，且根据淋巴结内是否存在对比剂充盈缺损及长、短径的改变有助于评价淋巴结的良、恶性质。
【关键词】 VX2;前哨淋巴结;淋巴结肿瘤转移;淋巴结反应性增生;计算机体层摄影;淋巴造影
Abstract：Objective To study the feasibility of indirect CT lymphography (CTLG) in localizing the sentinel lymphnodes (SLNs) of rabbits' breast and to evaluate the ability on CTLG in discriminating benign and malignant disease of lymphnodes. Methods
36 adult female rabbits were pided to 3 groups evenly and randomly. The VX2 tumor was transplanted into the right and second breast in the first group. The yolk colloid was injected in the right and second breast in the second group. The third group was taken as the normal control. After the animal modes was made， inject the Ultravist solution (370 mg I/mL) 1 mL in right and second breast and massage it 30 s in every rabbits. CT scanning was performed before and at 1， 15， 30， 45 and 60 min after contrast media injection. And then， Methylene Blue， with the same method and same dosage， was injected into the same place. Dissect the right armpit after massaging 30 s. Search blue lymphnodes and take them to the pathological examination.Results The excellent enhancement of all of the SLNs in right armpit was demonstrated. The peak enhancement was obtained 1min after injection. The peak value was (106.24±28.26)Hu. All of the afferent lymphatics of SLNs were visualized. The non-SLNs got the slight enhancement. The peak value was (59.43±11.62)Hu. A part of the afferent lymphatics of non-SLNs were visualized. The volume of the metastatic SLNs was larger than normal SLNs. And there was the phenomenon of filling defect of contrast media in them. The volume of the inflammatory SLNs was larger than normal SLNs too. There was not the phenomenon of filling defect of contrast media in them. The volume of the normal SLNs was small， and there was not the phenomenon of filling defect of contrast media in them. The 3D imaging was rebuilt with the CT scanning datus when 1min after injection. It was demonstrated clearly that the shape of SLNs and the relation with other structures in 3D imaging. In MIP imaging， the max-diameter and the min-diameter of the SLNs were：(10.33±2.63)and(7.50±1.82)mm (metastatic)，(8.09±1.64)and(4.72±0.53)mm (inflammatoy);(6.38±1.61)and(3.31±1.10)mm (normal). Statistics： there was noticeable difference between tumor group SLNs and normal group SLNs in the long-diameter and short-diameter (tumor group &>normal group， P&<0.05)，there was noticeable difference between inflammation group SLNs and normal group SLNs in the long-diameter and short-diameter (inflammation group &>normal group， P&<0.05)，there was noticeable difference between tumor group SLNs and inflammation group SLNs in the long-diameter and short-diameter (tumor group&>inflammation group， P&<0.05). The adjacent muscle of chest wall was not enhanced and the adjacent vein was enhanced slightly in CTLG. The number of visualized SLNs was the same as the blue dyeing. Conclusions CTLG is useful in localizing SLNs and their afferent lymphatics of rabbits' breast as well as evaluating the pathologic character of SLNs of rabbits' breast.
Key words：VX2; sentinel lymphnode， metastatic lymphnode; reactive hyperplasic lymphnode; computed tomography; lymphography
淋巴道转移是乳腺癌最常见的转移方式。研究认为，前哨淋巴结(sentinel lymph node，SLN)的荷瘤状态能够反应整个乳腺淋巴引流区域的肿瘤转移情况。因此，前哨淋巴结活检(sentinel lymph node biopsy， SLNB)成为近年来乳腺外科学的主要进展之一。SLNB的关键在于准确定位SLN。近年来，有国外学者将少量水溶性碘对比剂注入乳腺内，之后进行CT扫描，发现可以很好显示该侧乳腺的SLN及其引流淋巴管，并将这种方法命名为间接CT淋巴造影(indirect CT lymphography，CTLG)。我们认为，以CTLG定位SLN有很大研究空间，目前国内相关报道还不多见。本研究通过建立乳腺恶性肿瘤淋巴结转移以及乳腺炎症淋巴结反应性增生的动物模型，进一步研究CTLG定位和评价兔乳腺良、恶性病变SLN的可行性。
1 材料与方法
1.1 动物模型建立
36 只成年雌性日本大耳白兔，体重2.0～2.5 kg。VX2瘤株由辽宁医学院附属第一医院放射科雷振教授惠赠。将VX2冻存块缓慢解冻至室温，剪碎(直径0.5～1 .0 mm)，加适量生理盐水制成悬液，注射于兔后腿肌肉内传代。将36 只雌兔随机等分为3组，一组用于建立乳腺肿瘤淋巴结转移模型，一组用于建立乳腺炎症淋巴结反应性增生模型，另一组做空白对照。无菌条件下切取传代兔后腿实体瘤，生理盐水冲洗后置于培养皿中，取瘤体边缘生长旺盛的鱼肉样组织，剪碎，制成生理盐水悬液。将该悬液注射于肿瘤组兔右侧第2乳腺的乳垫下，每只给予1 mL。取新鲜鸡蛋黄按10%比重与生理盐水混合，经充分振荡后制成蛋黄乳胶，将该乳胶注射于炎症组兔右侧第2乳腺，每只各注射1 mL，3～4 d后重复1 次。对照组不进行任何处理。
1.2 CTLG检查
兔麻醉后仰卧，固定，伸展其四肢。首先进行CT平扫：应用GE LightSpeed 16层螺旋CT，层厚0.625 mm，螺距1.375，管电压80 kV，管电流120 mA，矩阵512×512，视野(FOV)16 cm×16 cm，扫描范围自兔颈根部至第2乳腺下方。之后进行CTLG操作：于各兔右侧第2乳腺的乳垫下方(肿瘤组可注入瘤内)及其周围3、6、9、12点4处皮下各注射碘普罗胺(370 mg/mL)0.2 mL (5处总剂量为1 mL)，注射后按摩注射部位30 s，以促进对比剂的吸收。于注射对比剂后1、15、30、45及60 min时分别进行CT扫描，扫描参数同前。扫描完成后将获得数据导入GE ADW4.2影像工作站，观察其轴位影像并进行3D重建。
1.3 亚甲蓝染色及病理学检查
完成CTLG 24 h内以亚甲蓝为示踪剂进行乳腺SLNB，注射部位及剂量同CTLG。注射后按摩局部30 s，再沿胸小肌旁切开腋筋膜，寻找蓝染淋巴管，并沿淋巴管检出SLN及其它淋巴结。记录染色淋巴结数目及位置，并与CTLG结果比较。其后立即以4%中性甲醛浸泡固定，经常规石蜡包埋、切片、HE染色后光镜下观察。
1.4 统计学分析
各组计量资料均值比较采用重复测量的方差分析，及单因素方差分析及两两比较的q检验。全部数据用SPSS13.0统计软件进行分析。
2 结 果
肿瘤组于注射VX2后第3周发现组内所有动物右侧第2乳腺肿块及同侧腋窝淋巴结明显增大。炎症组于首次注射鸡蛋黄乳胶7～8 天发现右侧腋窝淋巴结肿大，右侧第2乳腺未见明显异常。对照组未见异常。
CT平扫，肿瘤组及炎症组所有动物均可见右侧腋窝内1～2 枚肿大淋巴结，对照组于相同部位未见异常。CTLG发现，所有动物右侧乳腺引流区域的SLN明显强化，次级淋巴结轻度强化。肿瘤组显影SLN 12 枚，非SLN 15 枚。炎症组显影SLN 及非SLN各12 枚。对照组显影SLN 12 枚，非SLN 14 枚。各组SLN及非SLN于注射对比剂后1 min时CT值最高，以后逐渐降低，于注射后60 min时仍可见SLN轻度强化。SLN及非SLN各时刻的CT值见表1。形态上，肿瘤组SLN明显增大，并可见对比剂充盈缺损，部分非SLN亦有所增大，少数亦可见充盈缺损。炎症组SLN增大，但对比剂充盈良好。对照组SLN较小，对比剂充盈良好。利用注射对比剂后1 min CT扫描数据进行3D重建，可清晰观察各组SLN及非SLN形态，并可见SLN的输入淋巴管，部分动物可见非SLN的输入淋巴管(图1～3)。在适当角度的MIP影像上测量SLN长径和短径，具体测量数据见表2。各组SLN长、短径比较P值参见表3。在整个CTLG过程中，邻近胸壁肌未见强化，但邻近小静脉轻度强化。表1 CTLG不同时刻SLN、非SLN及邻近胸壁肌CT值(-(-近)±s，HU)表2 CTLG各组SLN的径线测量结果经q检验，除了长径炎组与对照组差别无统计学意义外，其余各组彼此间差异均有统计学意义
亚甲蓝染色时各组所显示的SLN、非SLN数目及位置与CTLG结果一致，非SLN输入淋巴管的显影数量较CTLG略多。病理检查发现，肿瘤组所有显影SLN均发生肿瘤转移，非SLN中有2枚发生肿瘤转移，有5枚反应性增生，其余正常。炎症组所有SLN均发生反应性增生，非SLN未见明显异常。对照组所有SLN及非SLN均未见明显异常。
3 讨 论
本研究的关键在于动物模型的建立和CTLG时机的选择。兔乳腺组织较少，血供不如内脏及肌肉丰富。尽管如此，VX2肿瘤的生长仍比较迅速，于种植后第2周即可触及注射部位的肿块，同期可于部分动物右侧腋窝触及淋巴结。在预实验中我们曾对这一阶段的肿大淋巴结进行病理检查，发现其肿大的原因主要为反应性增生，并非由于肿瘤转移所致。于种植后第3周再对肿大淋巴结进行病理检查时发现，此时绝大部分已发生转移，但仍能见到部分正常的淋巴结结构，此时淋巴结的状态多数为肿瘤转移和反应性增生并存。种植后第4周肿瘤原发灶已出现中央坏死，所有肿大淋巴结完全发生肿瘤转移，致使其正常结构破坏殆尽、输入淋巴管阻塞， 此时进行CTLG和亚甲蓝染色均无法显影。因此我们认为种植肿瘤后第3周内为成模时间窗，也是CTLG的时机。将新鲜鸡蛋黄与生理盐水混合作为炎性刺激物，反应较温和，动物耐受良好，在发现腋窝淋巴结肿大时，注射蛋黄乳胶侧乳腺未见红肿等外观改变，亦未触及肿块。此法相对于完全弗氏佐剂法操作简单，且效果相当。相对于肿瘤组，炎症组的成模时间窗则比较宽。在预实验中，曾对炎症组动物进行较长时间观察，发现首次注射蛋黄乳胶1周后即可使同侧腋窝淋巴结肿大，此后1个月时肿大淋巴结仍保持原有形态，第2个月时才发现肿大淋巴结形态萎缩、纤维组织增生。因此炎症组在发现腋窝淋巴结肿大的1 个月内均适合进行实验操作。
实质上，CTLG是传统X线淋巴管造影(Lymphangiography，LAG)的发展，它不仅是成像手段的改进(由X线平片改进为CT-3D影像)，更重要的是其在对比剂注射部位方面的变化。传统的LAG，其对比剂注射部位多位于肢体末端，对比剂走行为由肢体末端开始的向心性流动，可以显示其行程范围内的所有淋巴管、淋巴结，而对病变的局部淋巴引流特征难以揭示。CTLG对比剂注射部位是在病变附近，其流动方向与病灶的淋巴引流方向一致，能够有针对性的反应病变的局部淋巴引流特征。本研究发现，与对比剂注射部位越接近的淋巴管、淋巴结强化越明显，这主要是由于SLN对淋巴的滤过作用造成的。此外，水溶性对比剂在走行过程中的渗出也是造成远处淋巴管、淋巴结密度减低的重要因素。这种现象在以定位SLN为目的的CTLG时是有利的，由于强化程度不同，有助于辨别SLN和非SLN。在进行CTLG时发现，注射对比剂后1 min时SLN及非SLN强化最显著，以后其CT值逐渐降低。我们认为这种现象与局部淋巴引流速度有关。兔乳腺的淋巴管十分细小，淋巴流动缓慢。在注射对比剂后进行了30 s的局部按摩，由于外力作用，使得局部淋巴循环加速，到达淋巴结的对比剂较多，因此1 min时强化最明显。在之后几个时刻的CT扫描前均未进行按摩，同时由于对比剂不断向周围组织渗透，及经邻近静脉引流，致使局部淋巴引流速度不断减慢，淋巴结CT值不断降低。在发生肿瘤转移的淋巴结中，CTLG时可见到一定程度的对比剂充盈缺损，这是由于在淋巴结的转移区域瘤组织较致密，对比剂不易渗透所致的。而反应性增生淋巴结对比剂充盈良好，是因为淋巴结内部结构完好，未被病变破坏，因此对比剂容易渗透。对各组SLN的长、短径的测量结果显示：肿瘤组SLN(病理证实均发生转移)的长、短径均最大，炎症组SLN(病理证实均存在反应性增生)次之，对照组最小。因此，根据淋巴结内对比剂是否存在充盈缺损及淋巴结长、短径的变化可以初步判定SLN良、恶性。在与亚甲蓝染色的结果进行对比后发现，CTLG对于显示SLN及其引流淋巴管的效果和前者一致，但显示非SLN输入淋巴管的效果不如亚甲蓝，这可能是由于实验动物体型过小及现有CT设备的空间分辨率不足，所以对于十分细小且强化不足的淋巴管无法显示。而亚甲蓝的染色结果是由肉眼观察得出，相对较敏感。
总之，CTLG技术可使SLN、其输入淋巴管及邻近非SLN强化，通过后处理可充分展示SLN形态、准确测量其大小及显示与其它淋巴结的引流关系，这对于定位SLN并初步判断其良、恶性具有十分重要的意义。本研究进一步证实了CTLG定位和评价乳腺病变SLN的可行性，同时也希望能够为进一步的临床研究提供一定理论依据。
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