胞内感染病原体与细胞自噬相互作用的研究进展

【摘要】 　　细胞自噬是普遍存在于真核细胞中的细胞生物学行为，其主要作用是清除或降解细胞内受损伤的细胞结构、衰老的细胞器以及不再需要的生物大分子等，同时也为细胞内细胞器的构建或细胞结构的再循环提供原料。自噬作用在生物体生长发育、细胞分化及对环境应激的应答方面极为关键。在胞内感染细菌和病毒感染宿主细胞的过程中，自噬一方面能促进感染细胞对病原体的清除，另一方面，胞内感染病原体通过某些机制逃避细胞的自噬作用，与胞内感染的致病机制有关。作者对近期关于胞内感染的病原体与细胞自噬的相互作用的研究作一综述。

【关键词】 自噬； 胞内感染细菌； 病毒； 致病机制； 综述

　　［Abstract］ Autophagy is a common biological phenomenon in eukaryotic cells.The main function of autophagy is eliminating the injured cellular composition， aged cellular organs， giant molecule，and degradation of a cell′s own components.In the mean time autophagy provide materials for the construction of intracellular organs，which is called recycling of cellular composition.Autophagy plays an essential role in cell growth，differentiation and environmental stress.Autophagy enhance the eliminating of the intracellular pathogen，on the other hand the intracellular pathogens escape the autophagy.The interaction between them is related to the pathological mechanisms.This review mainly focuses on the current research of the mechanism of interaction between intracellular pathogen and autophagy．

　　［Key words］ autophagy； intracellular bacteria； virus； pathological mechanisms; review
　　
　　自噬性细胞死亡的现象早在20世纪60年代就已被发现，它是指细胞内的溶酶体降解自身细胞器和其他大分子的过程。当细胞在缺乏营养或发生应激反应时，可发生细胞自噬现象(autophagy)。细胞开始自噬时，细胞质中形成大量由双层膜包裹着的待降解物质的泡状结构，称自噬小体(autophagosome)，随后，自噬小体与溶酶体发生融合形成自噬溶酶体，自噬泡所包裹着的待降解物质在溶酶体所含酶的作用下分解成氨基酸和核苷酸等，并进入三羧酸循环，产生小分子和能量(ATP)，再被细胞所利用。因此，长期以来细胞自噬被认为是细胞的自救行为，溶酶体参与其中的全过程。自噬在生理过程的作用大体可以分为3种：参与细胞的发育和分化过程；营养缺乏时产生氨基酸；清除不需要的和损伤的细胞器与分子［1］。
　　
　　近来研究发现，细胞自噬在胞内感染性病原体的防御机制方面也发挥重要作用。一方面，胞内感染性细菌和病毒在逃脱非吞噬细胞的内吞体后，可被自噬体内化、降解，从而促进细胞对胞内感染的病原体的清除［2］；另一方面，胞内感染病原体通过某些机制逃避宿主细胞的自噬，与胞内感染性病原体的致病机制有关［3-8］。
　　
　　1 胞内感染性细菌与细胞自噬
　　
　　最近研究表明，细胞自噬是对抗胞内细菌感染最有效的武器，通常情况下，胞内细菌被宿主细胞内吞后进入胞浆，宿主细胞会启动自噬途径，自噬小体将其包裹，并运送到溶酶体中降解。
　　
　　目前认为，胞内感染性细菌的致病机制可能与病原体入侵细胞后干扰细胞的自噬过程有关：干扰自噬体与溶酶体的融合避免被降解；通过分泌某种蛋白延缓自噬体向自噬溶酶体的转变从而停留在自噬体样结构的囊泡中复制；在免疫系统的巨噬细胞中分泌的蛋白促进自噬体样结构的形成；或者干扰自噬体的成熟，促进自身的存活。
　　
　　结核分枝杆菌是一种胞内感染病原体，其致病机制可能与干扰自噬体与溶酶体的融合、抑制自噬途径使得自噬体中的结核分枝杆菌不被降解等有关。Gutierrez等［3］发现，采用饥饿或雷帕霉素(rapamycin)上调宿主细胞的自噬时，结核杆菌会被转运到感染细胞的溶酶体中降解，雷帕霉素的药理刺激使得吞噬小体的生成聚集从而促进自噬。同时发现，自噬相关基因产物Beclin1刺激吞噬小体的聚集，Beclin1是hVPS34PI3K(人类空泡蛋白34磷脂酰肌醇3激酶)复合体上的促进自噬的亚基，含有结核分枝杆菌的吞噬体与Beclin1相连接，促进含菌空泡体的发生自噬，从而使得结核杆菌减少。LC3(微管相关蛋白轻链3)是唯一被发现的自噬体特征性标记，定位在自噬体的双层膜上。Gutierrez等［3］还发现，加入IFNγ不仅使巨噬细胞的LC3含量发生变化，而且结核杆菌与LC3发生共同定位现象，自噬的诱导使得胞内生存的成熟结核杆菌减少，该共同定位现象能被自噬阻断剂(3MA，wortmannin)所拮抗，提示IFNγ抗结核菌的效应可能与诱导巨噬细胞产生自噬有关。Jagannath等［4］也发现，用野生型结核分支杆菌减毒菌株或卡介苗(BCG)干预的小鼠，在雷帕霉素诱导的自噬作用下，抗原呈递细胞表达抗原Ag85B明显增强，雷帕霉素还使得结核分支杆菌局限在感染细胞的自噬小体和溶酶体中。
　　
　　Ogawa等［5］报道，志贺杆菌(Shigella Flexneri)通过Ⅲ型分泌系统(the type Ⅲ secretion system，TTSS)所分泌的蛋白IcsB(志贺杆菌质粒编码的蛋白，定位在细菌表面)逃避宿主细胞的自噬；作者采用MDCK细胞(狗肾上皮细胞)作为志贺杆菌的感染模型，研究发现，感染6 h后，野生型志贺杆菌的IcsB与自噬小体标记LC3共同定位率只有10%～15%，而突变型贺杆菌的△icsB与自噬小体标记LC3共同定位率上升至50%。在缺乏氨基酸的饥饿条件下感染1 h，野生型志贺杆菌和突变型贺杆菌(△icsB)与自噬小体标记LC3共同定位率均有所增加(野生型志贺杆菌10%～16%；突变型贺杆菌23%～36%)；而采用自噬抑制剂(如3MA，Wortmannin)干预时，野生型志贺杆菌和突变型贺杆菌(△icsB)与自噬小体标记LC3共同定位率均明显减少，该现象提示志贺杆菌表面的IcsB蛋白与野生型志贺杆菌逃避宿主细胞的自噬作用有关。VirG蛋白(志贺杆菌Vir基因编码，参与肌动蛋白有关的细胞内运动)作为一种细菌靶分子，宿主细胞的自噬相关蛋白Atg5能与VirG蛋白特异性结合，从而诱导细胞自噬。进一步研究显示，IcsB并不直接抑制自噬，而是封闭或阻断Atg5与VirG的特异性结合，进而间接地阻断自噬体包裹志贺杆菌，引起志贺杆菌的细胞内感染［5］。
　　
　　沙门菌(Salmonella)和军团菌都可以利用分泌系统影响自噬途径。细菌分泌的蛋白可以促进自噬体样结构的形成，或者干扰自噬体的成熟，促进自身的存活。沙门菌可以引起巨噬细胞的程序性细胞死亡，促进自噬体样结构的形成，这个过程是依赖于Ⅲ型蛋白分泌系统。SipB是一种具有膜融合作用的蛋白质，它通过Ⅲ型蛋白分泌系统被送到宿主细胞中。沙门菌表达SipB时，能形成独特的、洋葱样的膜结构，该膜结构包含了线粒体和内质网，从而使细胞缺乏能量供应，细胞发生程序性死亡。而这种程序性死亡既有Ⅰ型程序性死亡的特征(如染色质及DNA的破坏)，又有Ⅱ型程序性死亡即自噬的特征(如不需要启动凋亡基因的活化)，而在沙门菌感染巨噬细胞时，SipB可以在肿胀的线粒体中发现。沙门菌感染的巨噬细胞可以出现自噬小泡的聚集，由此可以推测沙门菌通过SipB分裂线粒体引发自噬活动，从而造成巨噬细胞的死亡［6］。
　　
　　而嗜肺军团菌逃避溶酶体的融合、在胞内的复制以及宿主细胞的溶解是依赖dot/icm基因复合体编码出的Ⅳ型分泌系统，空泡小体包裹嗜肺军团菌的过程比典型的自噬体包裹过程要慢，它还通过Ⅳ型分泌系统释放阻碍吞噬小泡成熟的因子，使溶酶体酶的作用延迟。自噬体和包裹嗜肺军团菌的吞噬小泡在最后阶段都需要溶酶体的特性，如LAMP1(溶酶体联合膜蛋白1)、组织蛋白酶D、pH呈酸性等，但在成熟过程中，一部分的吞噬小体在特定自噬的标志(如Atg7，LC3等)下发生聚集。对于嗜肺军团菌感染过程的分析表明，细胞内的分泌途径对自噬途径有很大影响［7］。
　　
　　近来研究发现，幽门螺旋杆菌的感染会诱发巨噬细胞产生自噬小体，并且在其中进行复制，部分台湾临床菌株可在巨噬细胞中的双层膜结构中进行复制，自噬小体的形成与幽门螺杆菌的复制呈相关关系。如采用雷帕霉素(自噬的诱导剂)上调细胞的自噬水平，幽门螺杆菌的复制亦上调；而采用3MA(3甲基腺嘌呤，自噬的特异性的抑制剂)下调细胞的自噬，幽门螺杆菌的复制则被下调［8］。
　　
　　2 病毒感染与细胞自噬
　　
　　病毒与细胞自噬相互作用的结果大致分为3种：一是自噬成功的阻止了病毒的复制；二是病毒病毒阻断了自噬，或者是诱导某些不完全的自噬过程，从而避免了自噬对其复制的限制；三是病毒利用自噬小体的形成促进自身的复制［9-13］。

　　
　　自噬在病毒感染中起到的积极作用主要表现在其呈递抗原成分，并被胞内受体探测到，从而启动自噬反应。水痘带状疱疹病毒(VSV)与Toll样受体(TLR7)的结合诱导了浆细胞样树突状细胞(pDCS)的激活以及Ⅰ型干扰素(IFNⅠ)的分泌，从而启动了自噬反应，抑制了病毒的复制。有研究［9］表明，VZV诱导的自噬最终导致细胞质蛋白的变性，自噬被聚丙乙酸敏感的病毒产物所临时触发，在VZV感染的体外培养细胞自噬的降解途径发生在较晚的时间点。检测自噬标记物LC3B、p62/SQSTM1以及电镜观察结果显示，自噬小体在感染早期形成而在感染晚期进行降解，说明一些早期出现的病毒其基因产物的积累可能是自噬过程的主要刺激者［9］。
　　
　　某些病毒感染能激活宿主细胞的自噬途径，有研究［10］表明，一些RNA病毒感染时诱导形成自噬体样结构，双链RNA活化的蛋白激酶受体(PKR)激活的下游事件之一是Beclin1依赖的自噬途径的激活，它通过磷酸化真核细胞翻译起始因子eIF2α启动胞内相应的蛋白质的翻译，从而抑制或下调病毒复制，同时诱导自噬途径。而γ134.5基因编码的产物ICP34.5可以通过磷酸酶使eIF2α去磷酸化而拮抗PKR的作用，从而抑制自噬，这可以成为病毒的对宿主细胞造成破坏的机制。1型单纯疱疹病毒(HSV1)的神经毒力因子ICP34.5(由γ134.5基因编码)有与自噬的调节因子Beclin1结合的结构域，可以通过与自噬的调节因子Beclin1的互相作用阻断自噬过程，其具体机制现尚未阐明。用野生型HSV1的感染鼠的胚胎成纤维细胞(MEFs)，并没有发现长寿命蛋白降解数量上的明显增加或者是自噬体总体积的明显增大，自噬体形成指标未见明显增加；而γ134.5基因缺陷型HSV1感染细胞，则发现自噬形成指标LC3明显增加。
　　
　　电镜观察［11］显示，丙型肝炎病毒(HCV)感染能诱导宿主细胞自噬小体空泡样结构的生成，HCV感染可诱导细胞内质网压力的产生，使细胞在逆境下发生错误折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)，使许多未折叠或错误折叠的蛋白质聚集。先前研究［11］证实，细胞内质网压力可借UPR途径诱导细胞自噬小体的产生，HCV诱导宿主细胞自噬小体空泡样结构的形成需要UPR的参与，如果利用siRNA抑制UPR途径上重要分子的活性，将会抑制HCV诱导LC3的脂化，导致LC3Ⅱ的下调，进而阻碍自噬体的形成，从而促进病毒的复制。对HCV感染细胞的长寿蛋白降解速率以及在自噬溶酶体水平的研究表明，虽然HCV诱导自噬小体空泡样结构的生成，但不能加强自噬蛋白的降解速率，而是抑制感染细胞内自噬体与溶酶体的融合，阻碍自噬反应的持续进行。总之，这些研究表明，HCV病毒能够阻止自噬之类的细胞反应，甚至为其复制服务，而自噬及内质网压力对病毒的复制产生了一定推动作用［12］。
　　
　　而还有一些病毒，比如人类免疫缺陷病毒(HIV)可应用自噬的分子机制为自身服务［13］。HIV在旁观CD4+T细胞中诱导自噬依赖性的凋亡或者自噬细胞的死亡，这种情况发生在HIV1的包裹蛋白与趋化因子受体CXCR4［趋化因子基质细胞衍生因子1(CXCL12)的特异受体］在CD4+细胞表面的结合。包膜蛋白介导的自噬需要触发CD4+T细胞的凋亡，从而表明HIV感染诱导的自噬促进了旁观CD4+T的破坏。在急性感染中，HIV感染的细胞可以通过Beclin1和LC3Ⅱ这些自噬标志的下调检测到自噬活动的下调。自噬在病毒诱导的细胞死亡中并不是单独起作用，而是协助细胞凋亡作用，HIV病毒调节细胞的自噬性死亡可以看作是病毒规避免疫系统并且促进自身复制的一种方式。
　　
　　3 问题与展望
　　
　　目前分子生物学家和细胞生物学家对自噬及自噬性程序性细胞死亡的认识还处于初级阶段，关于自噬现象的参与分子、信号转导过程、病理生理学意义的研究还有待进一步深入。自噬给我们提供了一个研究细胞内生物化学机制的独特途径，而胞内感染的病原体对自噬应答的作用可以进一步帮助我们探究自噬反应的调控，同时使我们更加明确病原体对机体的损伤机制，我们也可以合理利用自噬争取在创新药物、改进疫苗等方面有所发展。

参考文献

　　［1］YORIMITSU T，KLIONSKY D J.Autophagy: molecular machinery for selfeating［J］.Cell Death and Differ，2005，12(2):15421552．

　　［2］LEVINE B.Eating oneself and uninvited guests:autophagyrelated pathways in cellular defense［J］.Cell，2005，2(120):21592162．

　　［3］GUTIERREZ M G，MASTE R S S，SUDHA B.Autophagy is a defense，mechanism inhibiting BCG and mycobacterium tuberculosis survival in infected macrophages［J］.Cell，2004，6(119):753766．

　　［4］JAGANNATH C，LINDSEY D R，DHANDAYUTHAPANI S，et al.Autophagy enhances the efficacy of BCG vaccine by increasing peptide presentation in mouse dendritic cells［J］.Nat Med，2009， 15(3):267276．

　　［5］OGAWA M，YOSHIMORI T，MIZUSHIMA N，et al.Escape of intracellular Shigella from autophagy［J］.Science，2005，4307(5710):727731．

　　［6］HERNANDEZ L D，PYPAERT M，FLAVELL R A，et al.Salmonella protein causes macrophage cell death by inducing autophagy［J］.J Cell Biol，2009，5(163):11231131．

　　［7］CAMPOY E，COLOMBO M I.Autophagy in intracellular bacterial infection［J］.Biochim Biophys Acta，2009，1793(9):14651477．

　　［8］WANG Y H，LEI H Y.The Autophagic induction in helicobacter pyloriinfected macrophage［J］.Exp Biol Med，2009，234(2):171180．

　　［9］TAKAHASHI M N，JACKSON W，LAIRD D T，et al.Varicellazoster virus infection induces autophagy in both［J］.Virol，2009，83(11):54665476．

　　［10］TALLCZY Z，JIANG W，VIRGIN H W，et al.Regulation of starvation and virusinduced autophagy by the elF2 alpha kinase signaling pathway［J］.PNAS，2002，99(1):190195．

　　［11］OGATA M，HINO S I，SAITO A，et al.Autophagy is activated for cell survival after endoplasmic reticulum stress［J］.Molecular Cell Biology，2006，26(24):92209231．

　　［12］SIR D，CHEN W L，CHOI J，et al.Induction of incomplete autophagic response by hepatitis C virus via the unfolded protein response［J］.Hepatology，2008，48(4):10541061．

　　［13］GOUGEON M L，PIACENTINI M.New insights on the role of apoptosis and autophage in HIV pathogenesis［J］.Apoptosis，2009，4(14):501508.