骨髓间充质干细胞对小鼠肉瘤细胞S180生长的影响

【摘要】 目的：研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)对小鼠肉瘤细胞S180生长的影响，并探讨其可能的机制。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离、纯化、扩增小鼠BMSCs，流式细胞术检测其细胞表面分子的表达。收集小鼠BMSCs上清液，采用MTT法检测其对小鼠S180细胞的生长抑制效应;流式细胞术检测细胞凋亡率;RTPCR检测p53、bcl2 mRNA的表达情况。结果：密度梯度离心法结合贴壁培养法能有效分离、纯化小鼠BMSCs，流式细胞术分析结果显示培养的小鼠BMSCs阳性表达CD44(86.53%)、CD29(95.27%)，阴性表达CD34(3.57%)。MTT法结果显示，小鼠BMSCs上清液可明显抑制S180细胞的生长，呈时间剂量依赖性;经40%、80%上清液作用48 h后的凋亡率分别为14.17%、29.77%，明显高于对照组的4.23%(均P&<0.01);p53及bcl2 mRNA均表达，小鼠BMSCs上清液可上调p53 mRNA表达，下调bcl2 mRNA表达。结论：小鼠BMSCs上清液可抑制小鼠S180细胞的生长并诱导细胞凋亡，其机制可能与上调p53、下调bcl2基因表达有关。

【关键词】 骨髓间充质干细胞; 肉瘤细胞; 小鼠; p53基因; bcl2基因

干细胞(stem cells，SCs)是一类具有自我更新和多向分化潜能的原始细胞，因其可塑性而成为当今生物医学领域最前沿、最活跃的主题之一。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)作为成体干细胞的重要分子存在于多种组织，主要包括骨髓、脂肪组织、骨骼肌、肝脏、脐带及外周血等。MSCs具有跨系统、跨胚层分化的潜能及来源广泛、取材方便、易分离纯化、免疫原性低、扩增力强和便于诱导等特性，已成为目前干细胞研究的热点[12]，是干细胞疗法中的重要种子细胞。

　　近来，恶性肿瘤的发病率已升到疾病谱的第二位，成为严重威胁人类生命和健康的疾病。其主要特征是肿瘤细胞的恶性生长、转移及复发，其病因和发病机制尚不清楚。目前对肿瘤的治疗主要靠传统的手术、化疗、放疗三大治疗手段，虽能切除或缩小肿瘤，但却不能有效防止肿瘤的转移和复发。MSCs作为当今干细胞研究的热点，其与肿瘤关系的研究方兴未艾。一方面，有研究[36]表明MSCs可突变为肿瘤细胞，MSCs的长期临床应用可能存在致瘤的安全性问题。MSCs对肿瘤生长的影响意见不一，如Zhu等[7]把胚胎MSCs或成体骨髓MSCs和F6或SW480肿瘤细胞共同植入小鼠皮下，发现胚胎MSCs和成体骨髓MSCs均能促进肿瘤生长。虽然MSCs在突变致瘤及促进肿瘤生长和转移方面已有一些报道，但也有相反的研究结果，如Nakamura等[8]实验发现大鼠原代MSCs在体外与9L胶质瘤细胞共培养，可以抑制9L胶质瘤细胞的生长。

　　我们从小鼠骨髓分离、培养并鉴定MSCs，以小鼠S180肉瘤细胞为研究对象，观察MSCs对S180细胞增殖凋亡及p53、bcl2基因表达的影响，为MSCs临床应用的安全性提供更多的实验依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物

　　雄性健康昆明小鼠，5～6周龄，质量18～20 g，购于东南大学医学院动物实验中心。

　　1.1.2 试剂及仪器

　　低糖DMEM(LGDMEM)培养基、RPMI 1640培养基(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，Percoll淋巴细胞分离液(Pharmacia公司)，胰蛋白酶、MTT、DMSO(Sigma公司)，DMF(N，N二甲基甲酰胺，国药集团化学试剂有限公司)，SDS(十二烷基硫酸钠，Serva公司)，AnnexinⅤ检测试剂盒(BD公司)，引物由Invitrogen公司合成，荧光标记抗小鼠抗体(CD34PE、CD29FITC、CD44PE， Pharmingen公司)，RTPCR试剂盒(TaKaRa公司)，流式细胞仪FACS Calibur(BD公司)，酶标仪(Model550，BIORAD公司)。

　　1.1.3 细胞及培养

　　小鼠肉瘤细胞S180购自中国科学院上海生命科学研究所细胞资源中心，在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中呈悬浮生长，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每3～4 d传代1次，实验选用对数生长期细胞。

　　1.2 方法

　　1.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离、纯化、扩增及鉴定

　　1.2.1.1 小鼠BMSCs分离、纯化及扩增 颈椎脱臼法处死小鼠，置于75%乙醇中浸泡5 min，无菌条件下分离出双侧股骨和胫骨，剔除脂肪、肌肉等组织，剪去干骺端，暴露骨髓腔，用1 ml无菌注射器抽取含10%胎牛血清的LGDMEM培养基，反复冲洗骨髓腔3～5次，直至骨发白为止。将骨髓液反复吹打制成单细胞悬液，然后缓慢将单细胞悬液贴壁注入预先加有质量浓度为1.073 g·L-1的等体积Percoll淋巴细胞分离液的离心管中，2 000 r·min-1离心30 min，吸取中间云雾状单个核细胞层，PBS洗涤2次，以2×105 ml-1密度接种于完全的LGDMEM培养基中(含青、链霉素各100 U·ml-1，胎牛血清10%)，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。3 d后首次换液，去掉非贴壁细胞，以后每2～3 d换液1次，8～12 d细胞生长融合达80%以上，以0.25%的胰蛋白酶消化贴壁细胞，按1传2比例传代培养，每2～3 d换液1次，直至细胞生长接近融合，再重复上述操作，反复传代扩增。

　　1.2.1.2 小鼠BMSCs鉴定 细胞传至第4代时用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，PBS洗涤2次，流式细胞术检测细胞表面CD34、CD29、CD44的表达情况。

　　1.2.2 小鼠BMSCs上清液的收集

　　实验选取第4、5代小鼠BMSCs，待细胞生长融合达80%以上时收集其上清液，0.22 μm滤膜过滤，分装，-70 ℃保存备用。

　　1.2.3 小鼠BMSCs对小鼠肉瘤细胞S180生长的影响

　　1.2.3.1 改良MTT法检测细胞生长抑制效应 取对数生长期细胞，接种于96孔板，每孔2×104个细胞，同时加入终浓度为10%、20%、40%、80%、100%的小鼠BMSCs上清液，另设空白调零组、阴性对照组，每组设3个复孔，分别培养24、48 h，然后每孔加入MTT 10 μl，继续培养4 h，加入SDSDMF裂解液(14%SDS溶于50%DMF去离子水中，pH调解液调pH至4.7)100 μl，于微量振荡器上轻轻振荡15 min，在自动酶标仪上读取A570 nm。抑制率=(1-A上清液组/A对照组)×100%。

　　1.2.3.2 流式细胞术检测细胞凋亡 收集经40%、80%上清液作用48 h的细胞及对照组细胞，用PBS洗涤2次，采用Annexin Ⅴ和PI荧光染色流式细胞术定量分析细胞凋亡率。

　　1.2.3.3 RTPCR法检测p53、bcl2 mRNA表达 收集经40%、80%上清液作用48 h的细胞及对照组细胞，Trizol法提取总RNA，按TaKaRa两步法试剂盒提供的说明书进行RTPCR操作。p53：上游引物为5′ATGAACCGCCGACCTATC3′，下游引物为5′TGGGCATCCTTTAACTCTAA3′;bcl2：上游引物为5′GGTTGCCTTATGTATTTGTTTG3′，下游引物为5′CCTCCGCAATGCTGAAAG3′;内参为βactin。RTPCR产物行琼脂糖凝胶电泳，数字成像系统拍照分析。

　　1.3 统计学处理

　　实验所得数据以x-±s表示，利用SPSS 13.0软件包进行统计学分析。两组间的比较用t检验，多组间的比较采用单因素方差分析;用Probit回归分析计算半数抑制浓度(IC50)，检验水准α=0.05。

　　2 结 果

　　2.1 小鼠BMSCs分离、纯化及扩增

　　从小鼠骨髓获得的单个核细胞为比较一致的球形细胞，悬浮于培养液中，接种24 h后少部分细胞开始贴壁生长，为均一的单个圆形或多角形细胞，2 d时细胞逐渐变为梭形，1周时细胞大部分为梭形或纺锤形，10 d左右时细胞贴满瓶底。然后进行传代培养，传代后细胞增殖迅速，一般3～4 d可传1代。见图1。

　　图1 培养10 d的原代BMSCs ×100

　　2.2 小鼠BMSCs鉴定

　　流式细胞术分析结果显示，培养的第4代BMSCs表达CD44(86.53%)、CD29(95.27%)，不表达CD34(3.57%)，说明分离获得的细胞符合BMSCs的特点。见图2。

　　2.3 改良MTT法检测细胞生长抑制效应

　　改良MTT法检测结果显示，10%～100%的小鼠BMSCs上清液对S180细胞有生长抑制作用，呈时间剂量依赖性(图3)，各浓度组之间的差异均具有统计学意义(P&<0.01)。各时间组之间在浓度为80%、100%时差异具有统计学意义(P&<0.05)，而在低浓度时差异无统计学意义。48 h的IC50为84.43%。图2 第4代小鼠BMSCs表面标志

　　图3 不同浓度上清液作用不同时间S180细胞生长曲线

　　2.4 小鼠BMSCs上清液对S180细胞凋亡率的影响

　　随着上清液作用浓度的增加，细胞凋亡率也逐渐增加，40%、80%上清液作用48 h后的凋亡率分别为14.17%、29.77%，而空白对照组的凋亡率为4.23%，各组间的差异具有统计学意义(P&<0.01)。见图4。

　　2.5 小鼠BMSCs上清液对p53、bcl2 mRNA表达的影响 在S180细胞中存在p53、bcl2 mRNA的表达;40%、80%上清液作用48 h后，p53、bcl2 mRNA的表达情况见图5。经图像处理分析系统分析得出p53、bcl2及βactin的灰度值，以βactin灰度值为参照，得出p53、bcl2 mRNA表达的半定量结果：随着上清液浓度的增加，p53 mRNA表达有增加趋势，bcl2 mRNA表达有减少趋势(均P&<0.01)。图4 上清液作用48 h后S180细胞凋亡率

　　3 讨 论

　　3.1 小鼠BMSCs分离、纯化、扩增及鉴定

　　BMSCs在骨髓中的含量极低，只有0.001%～0.01%[9]，且在体外培养条件下，仅有少数BMSCs能够活跃地复制[1011]。因此，如何获得高纯度、足量的BMSCs成为BMSCs应用研究的关键。然而目前对BMSCs的分离、纯化、扩增还没有统一的方法。BMSCs分离、纯化的方法主要有贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法和免疫磁珠分选法[12]。本研究采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法进行小鼠BMSCs的分离、纯化、扩增，具有操作简便、快速实用、对细胞活性影响小等优点，是比较理想的方法。

　　BMSCs目前还没有公认的特异性表面标志物[13]。它表达一些与间质细胞、内皮细胞和表皮细胞共有的细胞表面标志[11]，如细胞表面抗原CD44、CD73、CD71、CD29、CD90、CD105、CD106等，不表达造血细胞表面抗原，如CD34、CD14、CD45。本研究选择常用的代表性表面抗原进行多项指标的流式细胞联合检测，结果显示，培养的第4代小鼠BMSCs CD44、CD29阳性，CD34阴性，表明本研究所获得的细胞为非造血系细胞，符合BMSCs的特点。

　　M.Marker;1.对照组; 2.40%上清液组; 3.80%上清液组

　　图5 上清液作用48 h后基因表达情况

　　3.2 小鼠BMSCs对S180细胞生长的影响

　　干细胞的研究与应用是21世纪生命科学中最令人瞩目的领域之一，在组织器官移植、细胞治疗和基因治疗中具有重要的意义。目前BMSCs与肿瘤细胞之间关系的研究受到越来越多学者的关注，然而BMSCs对肿瘤细胞增殖的作用目前还不十分明确，存在一些争议。

　　Zhu等[7]把胚胎MSCs或成体BMSCs和F6或SW480肿瘤细胞共同植入小鼠皮下，发现胚胎MSCs和成体BMSCs在体内均能促进肿瘤生长。病理学检查显示，肿瘤组织富含血管、广泛坏死并侵袭周围正常组织，表明肿瘤细胞与MSCs共同皮下移植，增强了肿瘤组织的增殖能力、血管形成能力以及转移能力。另有研究发现，U87神经胶质瘤小鼠接受BMSCs后生存期较短，因此认为BMSCs可能迁移至肿瘤处创造了一个利于肿瘤生长的微环境[14]。

　　Ohlsson等[15]发现，将大鼠BMSCs和大鼠结肠癌细胞H1D2共同移植到大鼠皮下，BMSCs可明显抑制肿瘤的生长，移植后5～7 d，肿瘤处有明显的粒细胞和巨噬细胞浸润，移植后14 d无肉眼可见的肿瘤，30 d后检测不到肿瘤的存在。Khakoo等[16]在Kaposis肉瘤小鼠模型中观察到，静脉输注的人BMSCs可聚集到肿瘤处，并以剂量依赖的方式抑制肿瘤生长。乔玲等[17]发现，间充质干细胞可通过释放Dkk1抑制乳腺癌细胞MCF7 Wnt/βcatenin信号途径，从而抑制乳腺癌细胞的增殖。

　　本研究在细胞水平上采用小鼠BMSCs上清液作用于小鼠S180肉瘤细胞，从细胞增殖和基因表达两方面观察小鼠间充质干细胞对小鼠S180肉瘤细胞增殖的影响，并初步探讨其作用机制。MTT法结果显示，上清液对S180细胞有增殖抑制作用，且呈浓度和时间依赖性，随着浓度的增加和作用时间的延长，抑制作用也逐渐增强。Annexin Ⅴ/PI双染法流式细胞术结果提示随着上清液浓度的增加，细胞凋亡率逐渐增高。以上结果表明上清液有对抗S180细胞的作用，但其机制尚不明确。

　　细胞凋亡失控是导致肿瘤发生发展的重要方面，而且细胞凋亡也是多种肿瘤疗法作用的共同通路。细胞凋亡受许多因素的调节，其中包括多种癌基因和抑癌基因如cmyc、bcl2、p53、fas、细胞色素C、caspase、p21等。其中bcl2被认为是细胞凋亡基因家族中最重要的调控基因，也是被研究得最深入者之一。bcl2和bclx、bax、bad、bak等共同组成了bcl2基因家族，其表达产物位于线粒体内膜、核膜及内质网膜，在人体多种肿瘤中高表达，可以抑制多种致凋亡因素诱导的细胞凋亡[18]。p53基因是迄今为止已发现的与人类肿瘤发生相关性最高的抑癌基因，其主要生物学功能是通过调控DNA修复、细胞周期停滞和诱导细胞凋亡，维持基因组和细胞稳定，抑制肿瘤生长。p53基因与肿瘤的关系是多年来肿瘤研究领域一个非常重要的热点。本实验研究结果显示，在小鼠肉瘤S180中存在p53、bcl2 mRNA的表达，与对照组相比，经40%、80%上清液作用48 h后，p53 mRNA的表达上调，bcl2 mRNA的表达下调，差异具有统计学意义(P&<0.01)。因此，我们推测p53 mRNA的表达上调、bcl2 mRNA的表达下调可能是小鼠MSCs诱导S180细胞凋亡的分子机制之一。

　　本研究证实，BMSCs可以抑制小鼠S180细胞的生长，因此BMSCs移植有望成为肿瘤治疗的新策略。然而BMSCs与肿瘤之间的关系仍然存在争议，机制仍不十分清楚，因此，亟待进行更多的进一步研究，以保证BMSCs用于肿瘤临床治疗的安全性。

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