桑叶多糖PMP12的分离纯化及结构初步分析

　　　　作者：赵明， 常钰， 王佩香， 张磊， 欧阳臻

【摘要】 目的： 从桑叶中分离纯化获得均一多糖PMP12，并研究其组成及初步结构。方法： 桑叶经热水提取乙醇分级沉淀，脱蛋白、脱色，经DEAE纤维素和Sephadex G100凝胶柱层析，得到一个均一多糖组分PMP12，采用气相(GC)、高效液相(HPLC)、红外(IR)、核磁(NMR)、Smith 降解和糖醛酸还原等方法分析其组成和初步结构。结果： PMP12由鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)和葡萄糖醛酸(GluA)组成，其摩尔比为Rha∶Ara∶Gal∶GluA=1∶1.56∶1.57∶1.08;PMP12主链主要是以β1→3糖苷键连接的鼠李糖，侧链主要是以β1→2糖苷键及β1→4糖苷键连接的阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖醛酸。结论： 测定分析了桑叶多糖PMP12的组成和初步结构，为桑叶多糖的进一步研究提供依据。

【关键词】 桑叶; 多糖; 分离纯化; 结构分析

　　[Abstract] Objective: To study the isolation，the composition and characterization of polysaccharide PMP12 from Mulberry leaves. Methods： Mulberry leaves were extracted by boiling water. The polysaccharide in the filtrate was precipitated fractionally by alcohol. The protein in the product was removed by TCA and it was further purified by DEAE ion exchange cellulose (DEAE52)and SephadexG100，received PMP12.The composition and characterization of Mulberry leaves polysaccharide were researched by GC，HPLC， IR， 1HNMR， Smith degradation and uronic acid reduction and so on. Results： PMP12 is made up of rhammose，arabinose， galactose and glycuronic acid with the molarity rate of 1∶1.56∶1.57∶1.08; In the PMP12， the main chain is made up of β1→3linkedrhammose.The side chains are β1→2 and β1→4linkedarabinose，galactose and glycuronic acid. Conclusion： The structure of PMP12 was first determined from mulberry leaves.These work could establish foundation for further study of Mulberry leaves polysaccharides.

　　[Key words] Mulberry leaves; polysaccharide; separation and purification; structure analysis

　　桑叶为桑科(Moraceae)植物桑(Morus alba Linn.)的树叶。味苦、甘，性寒，归肺、肝经，桑叶具有极高的营养和药用价值，已经被卫生部正式归为药食两用植物。现代药理研究证明桑叶具有降血糖、降血压、抗菌和抗病毒等多种药理活性[1，2]。桑叶多糖为桑叶降血糖主要有效成分之一[3，4]，因此研究桑叶多糖成分，开发降糖新药和功能性食品的前景十分广阔。本实验室前期曾对桑叶多糖含量测定方法及单糖组成进行了研究报道[5，6]。目前对桑叶多糖的结构研究多为乙醇体积分数为80%分级沉淀得到的多糖[7，8]，未见对50%乙醇分级沉淀得到的多糖进行深入研究的报道。本文结合组分收率和初步降血糖药效试验[2]，对水提后50%乙醇分级沉淀得到的粗多糖采用DEAE52纤维素和Sephadex G100凝胶柱层析进行分离纯化，得到均一多糖组分PMP12，并采用气相(GC)、液相(HPLC)、红外(IR)、核磁(NMR)，Smith 降解和糖醛酸还原等方法对其组成和初步结构进行分析和研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与试剂

　　桑叶采集于江苏大学桑树园，经欧阳臻教授鉴定为桑科植物桑Morus alba L.的叶，干燥后，粉碎，备用。DEAE纤维素(Whatman公司)，Sephadex G100、标准单糖(Sigma公司)，三氯乙酸、醋酸酐、吡啶等为分析纯(上海化学试剂公司)。

　　1.2 仪 器

　　HP4890气相色谱仪(美国安捷伦公司);Startorius 电子天平(德国);紫外可见分光光度计(上海优尼科公司);恒流泵、自动分部收集器(上海沪西仪器厂);Buchi R200型旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司);冷冻干燥机(德国Christ公司);NEXUS670智能型傅里叶红外光谱仪(美国尼高利公司);BRUKER DRX500核磁共振仪(德国Bruker公司);高效液相色谱仪(日本分光公司)。

　　1.3 桑叶多糖PMP12的提取、分离与纯化

　　取粉碎后的桑叶1 kg，依次用石油醚、乙酸乙酯和95%乙醇回流脱脂，残渣干燥后加5倍量蒸馏水，90 ℃提取4次，合并提取液，减压浓缩。加30%的三氯乙酸脱蛋白，离心，除去变性蛋白，浓缩至一定体积，用氨水调pH值至8.0，加入过氧化氢进行氧化脱色(45 ℃保温1 h)。透析除去过氧化氢及有机溶剂和小分子杂质后，浓缩至一定体积，加95%乙醇，使含醇量达到50%，于4 ℃放置过夜，离心收集沉淀，复溶于水，再次醇析，冷冻干燥后得粗多糖组分MP1。经DEAE52纤维素和Sephadex G100凝胶柱层析，得较纯的水溶性多糖组分PMP12。

　　1.4 高效凝胶渗透色谱(HPGFC)测定多糖的纯度及相对分子质量[9]

　　样品及系列标准多糖分别经 HPGFC分析。色谱条件:Jasco HPLC 1500液相色谱系统，TSKGEL G4000PW色谱柱，示差折光检测器，柱温30 ℃，流动相为0.003 mol/L 醋酸钠，流速0.5 ml/min。标准品分别为2 000，500，70，40，10 ku的Dextran系列葡聚糖。根据样品峰型判断其纯度。由标准多糖的相对分子质量对数与保留时间求得标准曲线，再根据样品保留时间求得相对分子质量。

　　1.5 桑叶多糖的单糖组成分析[5]

　　取多糖PMP12 10 mg，加入2 mol/L的硫酸2 ml，封管，100 ℃水解6 h，中和水解液，离心，冷冻干燥;取各标准单糖和水解后的糖样，制备成糖腈乙酰化物，进行气相色谱分析。色谱条件:HP1 21 000 mm×0.2 mm弹性石英毛细管色谱柱;载气为氮气;检测器为氢火焰离子化检测器(FID);柱温的起始温度130 ℃保留5 min，程序升温4 ℃/min，中止温度240 ℃;汽化温度280 ℃;检测器250 ℃。

　　1.6 糖醛酸的还原[10]

　　称取多糖PMP12 20 mg于10 ml试管中，加2 ml水溶解，用0.1 mol/ml HCl调pH值至4.8。加入40 mg 水溶性的碳化二亚胺试剂(EDC)，室温下反应1 h，同时用0.04 mol/L HCl调节pH值使之保持在4.8。将反应物转移至50 ml烧杯中，加入2 ml新配的2 mol/L硼氢化钾，于50 ℃水浴反应1 h，再加入2 ml新配的2 mol/L 硼氢化钾，于50 ℃水浴反应50 min，加乙酸终止反应。反应物透析，冷冻干燥，干燥后的样品按上述操作再重复还原2次。冻干，水解，进行糖腈乙酰化后，进行气相色谱分析。

　　1.7 高碘酸氧化和Smith降解

　　称取多糖PMP12 15 mg，加入15 mmol/L 高碘酸钠15 ml，于室温，避光反应，每天定时取样，测定样品溶液在223 nm波长处的光密度值，直到光密度值恒定为止，加入乙二醇，终止反应，取2 ml氧化液，加2滴酚酞作指示剂，用0.01 mol/L NaOH滴定，计算甲酸生成量，剩余部分透析，加入NaBH4还原过夜，用50% 醋酸调pH值至5.5，透析，冷冻干燥，得多糖醇，水解，进行糖腈乙酰化后，进行气相色谱分析。

　　1.8 红外光谱的检测

　　取1～2 mg多糖样品，用溴化钾压片后，在500～4 000 cm-1范围内进行扫描。

　　1.9 核磁共振光谱的测定

　　取多糖样品10～20 mg装入样品管，溶于0.5 ml的重水(D2O)中，在核磁共振仪上进行1HNMR光谱分析，以四甲基硅烷(TMS)作内标。

　　2 结果与讨论

　　2.1 桑叶多糖的分离与纯化

　　分离纯化后的桑叶多糖PMP12为白色粉末，易溶于水，不溶于乙醇、 丙酮、乙醚等有机溶剂; PMP12紫外光谱图如图1所示，在波长260 nm及280 nm处无明显吸收峰，说明无核酸及蛋白质。

　　2.2 桑叶多糖的纯度及相对分子质量

　　桑叶多糖PMP12的凝胶色谱图如图2所示，桑叶多糖PMP12为单一对称峰，表明为均一多糖组分。根据标准曲线Y=-3.4367X+34.785(r=0.995)，保留时间12.540 min，得PMP12的平均相对分子质量大于100万。

　　2.3 桑叶多糖的单糖组成分析

　　各标准单糖的气相色谱如图3所示，桑叶多糖PMP12的水解产物和还原后的气相色谱如图4和图5所示，通过与标准单糖的保留时间和响应因子对比确定单糖的种类和摩尔比，结果表明，桑叶多糖PMP12由鼠李糖(Rhm)、阿拉伯糖(Ara)和半乳糖(Gal)组成，其摩尔比为Rhm∶Ara∶Gal=1∶1.56∶1.57。采用EDCNaBH4 法还原糖醛酸，并对其组成进行分析，各糖残基的摩尔比为Rhm∶Ara∶Gal∶Glu=1∶1.56∶1.57∶1.08。对比还原糖醛酸前后产物的组成结果分析，增加了葡萄糖

　　2.4 高碘酸氧化和Smith降解结果分析

　　桑叶多糖PMP12的高碘酸溶液经过7 d的测定，发现72 h后在223 nm的光密度趋于恒定。经NaOH滴定，发现桑叶多糖PMP12未产生明显的甲酸。初步可以推测PMP12结构中没有以1→6位键合的糖基或非还原末端基。

　　桑叶多糖PMP12经高碘酸氧化和 Smith 降解的产物中甘油的摩尔百分比为34%，鼠李糖基本未发生降解，可推测鼠李糖主要以1，3糖苷键形式存在;阿拉伯糖由原组成20.4%下降到5%，有76%发生了降解，表明阿拉伯糖主要以1，2或1，4糖苷键形式存在;葡萄糖醛酸由原组成26.5%下降到4%，有85%发生了降解，表明葡萄糖醛酸主要以1，2或1，4糖苷键形式存在;半乳糖由原组成32.2%下降到12%，有63%发生了降解，表明半乳糖主要以1，2或1，4糖苷键形式存在。

　　2.5 红外光谱结果分析

　　桑叶多糖PMP12的红外光谱图如图6所示，具有典型的多糖特征吸收峰，在3 395 cm-1处出现一宽峰，是糖分子内或糖分子间的氢键O-H伸缩振动的结果，2 924 cm-1处的吸收是次甲基(-Ch3-)中C-H伸缩振动引起的。 1 413 cm-1处的吸收峰属C-H的变角振动，它和C-H伸缩振动构成糖类的特征吸收峰。1 600～1 650 cm-1处的吸收峰是-CHO的C=O伸缩振动，1 075 cm-1为C-O-H或C-O-C结构中C-O键的弯曲振动;但未显示甘露糖的特征峰810及870 cm-1，说明PMP12不含甘露糖。

　　2.6 核磁共振光谱结果分析

　　桑叶多糖PMP12的氢谱(1HNMR)如图7所示， PMP12共振信号主要处在化学位移δ5.0的右侧，表明PMP12主要为β型糖苷键。

　　3 结 论

　　综合以上分析结果，桑叶多糖PMP12由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖醛酸组成，相对分子质量大于100万。桑叶多糖PMP12主链主要是以β1→3糖苷键连接的鼠李糖;侧链主要是以β1→2糖苷键及β1→4糖苷键连接的阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖醛酸。确切的分子结构还需借助甲基化等分析手段进行进一步分析研究。

　　关于桑叶多糖的结构及单糖组成已有一些报道，夏玮等[7，8]分离得到MPA1，MP3b，SDC，SDS1和SDT1五种多糖组分，MPA1是由葡萄糖组成的均多糖，重均相对分子质量(Mw)为1.1×105;MP3b由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸组成，相对分子质量为8.9×104;SDC由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、半乳糖醛酸组成，相对分子质量为8.0×103;SDS1的Mw=8.9×104，数均相对分子质量(Mn)=7.5×104;SDT1的Mw=1.54×104，Mn=1.42×104。陈玉斌等[11]分离得到一种相对分子质量为10万的酸性多糖，薄层检出含有半乳糖醛酸和鼠李糖。金春雁等[12]从湖桑中分离到一种酸性蛋白多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、半乳糖以及糖醛酸组成，该多糖的Mw为5.0×105，其中糖醛酸含量为5.33%，蛋白质部分占多糖总量的0.83%。与这些已报道的桑叶多糖相比，本文获得的PMP12在单糖组成和相对分子质量上与它们有所不同。因此可以确定桑叶多糖PMP12为首次从桑叶中获得的酸性杂多糖，其确切的分子结构及其活性正在进一步研究中。

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