BCGHPV16E7c疫苗对小鼠免疫效应的实验研究

　　　　 作者：黄斌，雷蕾，程晨，吴少庭，吴瑞芳

【摘要】 目的 研究卡介苗(BCG)人乳头状瘤病毒16型 (HPV16) E7c疫苗对小鼠的免疫效应和致病性。方法 用本研究组制备的BCGHPV 16E7c疫苗腹腔内接种清洁级BALB/c鼠， 同时设磷酸盐缓冲液(PBS)对照组、BCG空白菌对照组及BCGpBCG 3000空白载体对照组，用酶联免疫法检测各组血清特异性抗体、流式细胞仪测定脾脏T淋巴细胞亚群及肝、肺组织病理学检查。结果 免疫后第2周和第4周BCGHPV16E7c组每只小鼠的血清中检测到抗HPV16E7c特异性抗体，在第4周诱导产生的特异性IgG抗体滴度明显高于第2周，平均滴度为1∶200;免疫后第4周BCGE7c组与各对照组比较，CD8+T细胞的百分率显著升高(P&<0.05);免疫组小鼠肝、肺组织病理学检查和BCG对照组比较未观察到更为严重的病理学变化。结论 本研究组构建的BCGHPV16E7c疫苗能诱导小鼠的体液免疫应答和细胞免疫应答，对小鼠无明显的毒性作用。

【关键词】 宫颈癌;疫苗;人乳头状瘤病毒16型;免疫效应

　　 Immunological effect of BCGHPV16E7c vaccine in miceHUANG Bin1，LEI Lei2，CHENG Chen1，WU Shaoting2， WU Ruifang1 　(1. Department of Obstetrics and Gynecology， Shenzhen Hospital of Peking University， Shenzhen 518035， China)Abstract: Objective To study the immunological effect and pathogenicity of BCGHPV16E7c vaccine in mice. Methods The SPF BALB/c mice received intraperitoneal inoculation of selfmade BCGHPV16E7c vaccine， phosphate buffered saline (PBS)， BCG and BCGpBCG 3000， respectively. Serum specific antibody， splenic T lymphocyte subsets， and hepatic and pulmonary pathology were determined in 4 groups. Results Serum specific antibody against HPV16E7c was detected in BCGHPV16E7c group in the 2nd week， and its titer increased remarkably (average， 1∶200) in the 4th week. The percentage of CD8+ T cells in BCGHPV16E7c group was superior to that in other groups in the 4th week (P&<0.05). None of aggravated pathological changes occurred in BCGHPV16E7c group compared with BCG group. Conclusion The BCGHPV16E7c vaccine can induce the humoral and cellular immune response in mice， and has little toxicity.

　　Key words:cervical cancer; vaccine; human papillomavirous type16; immunological effect

　　宫颈癌是发生在全球妇女中第二大常见的恶性肿瘤[1]，其病死率已跃升各类妇科肿瘤之首[23]。全球每年新发例约50万，死亡例数约 25万， 我国每年有12万的新发病例，且每年约有2万妇女死于宫颈癌[4]。而人乳头瘤病毒(HPV)与宫颈癌之间有较为明确的病因学联系， HPV感染是宫颈上皮内瘤(CIN)形成以及宫颈癌发生的主要危险因子， 其中HPV16型最为常见。因此，研究HPV疫苗对防治宫颈癌有重大意义。本研究组已成功构建BCGHPV16E7c疫苗， 现就该疫苗对小鼠的免疫效应报道如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物及疫苗

　　BCGHPV16E7c疫苗、pETE7C重组蛋白、BCGpBCG3000空白载体为本课题组制备。清洁级BALB/c小鼠，6～8周龄，购于广东中医药大学实验动物中心。

　　1.2 主要试剂

　　Pet23a表达载体质粒购于Invitrogen公司，BCG上海株购于成都生物制品研究所，EZSepTMMouse1淋巴细胞分离液、LymphoSpotTM无血清培养基购于深圳达科为公司，CD3eFITC CD4PE、CD8aPE单抗购于eBioscience公司。

　　1.3 试验小鼠的分组和免疫接种

　　清洁级BALB/c、6-8周龄雌性小鼠32只，随机分4组，每组8只小鼠：PBS(磷酸盐缓冲液)对照组、BCG空白菌对照组、BCGpBCG3000空白载体对照组、BCGE7c免疫组，于0周时，分别以PBS溶液100 μL及107CFU/mL的各BCG 100μL腹腔内接种各鼠。

　　1.4 血清特异性抗体的检测

　　分别于第2、4周从各实验组取鼠4只，检测血清特异性抗体。摘小鼠眼球采血，分离血清，将抗原(pETE7C重组蛋白)包被于聚苯乙烯96孔反应板(10 μg/孔)，4℃过夜，PBST(含0.01%吐温-20的PBS溶液)洗涤;每孔加入200μL含1%BSA(牛血清白蛋白)的PBST封闭，4℃过夜;以小鼠免疫血清为一抗，每孔加入用封闭液对倍稀释的免疫血清100 μL，37℃ 1h， 洗涤;以封闭液(1∶5000)稀释的抗鼠IgG为二抗，每孔加入100 μL， 37℃ 1h， 洗涤;向微孔加一滴入底物(h3O2)和加一滴显色剂(TMB显色液)，振荡混匀，避光37℃反应10 min， 加一滴终止液(2Mh3SO4)，酶标仪式450 nm读数，免疫前小鼠血清为阴性对照，样品孔A值/阴性对照A值大于2.1为阳性，测定血清特异IgG滴度。

　　1.5 脾脏T淋巴细胞亚群的测定(CD3+/CD4+，CD3+/CD8+)

　　颈椎脱臼处死后的小鼠，无菌分离脾脏置于盛有5mL EZSepTMMouse1淋巴细胞分离液的平皿中;在200目尼龙筛网上轻轻研磨小鼠脾脏，收集网下的细胞转移至15 mL离心管中;覆盖500 μL 1640培养基，以吊蓝式离心机800 g离心30 min;吸取第二层云雾状的低密度细胞，转移至新离心管;加入1640培养基至10 mL，250 g离心10 min以洗涤细胞;加入1mL LymphoSpotTM无血清培养基重悬细胞;细胞计数并调整细胞浓度以含10%小牛血清+双抗1640完全培养基调整细胞浓度为5×106/mL;每一样本分别吸取200 μL脾细胞悬液(5×106/mL)加入2EP管中;管1中加入兔抗鼠CD3FITC和CD4PE， 管2中加入兔抗鼠CD3FITC和CD8PE， 另设PERatIgG2a和FITCRatIgG2b的同型对照;40C避光孵育30 min后1mLPBS洗涤2次，弃PBS;500μL 1%多聚甲避光醛固定后流式细胞仪测定CD4+、CD8+T细胞。

　　1.6 小鼠肝、肺组织病理学检查

　　颈椎脱臼处死后的小鼠，无菌取肝和肺(每组第1～3只)，按常规石腊切片及HE染色步骤制备组织病理标本。

　　1.7 统计学处理

　　应用SPSS 13.0统计软件进行分析，采用方差分析及Dunnett检验，以P&<0.05为差异有统计学意义。

　　 2 结果

　　2.1 血清特异性抗体的检测结果

　　免疫后第2周和第4周BCGE7c组每只小鼠的血清中检测到抗E7c特异性抗体，在第4周诱导产生的特异性IgG抗体滴度明显高于第2周，平均滴度为1∶200，见图1。

　　图1 各组小鼠血清特异性抗体的检测结果

　　2.2 脾脏T淋巴细胞亚群的测定结果

　　免疫后第2周BCGE7c组与各对照组比较，小鼠脾淋巴细胞CD4+和CD8+T细胞的百分率均无明显变化(P&>0.05)， 免疫后第4周BCGE7c组与各对照组比较，小鼠脾淋巴细胞CD4+T细胞的百分率升高，但差异无统计学意义(P&>0.05)，CD8+T细胞的百分率显著升高(P&<0.05)。见表1。表1 各组小鼠脾脏T淋巴细胞亚群测定结果*与各对照组比较：P&<0.05。

　　2.3 肝和肺组织病理学检查

　　第2周和第4周免疫鼠肝和肺病理学变化无明显区别，PBS对照组无炎症反应同接种前的正常组织学;空白BCG组、BCGPbcg3000空白载体组、BCGE7c免疫组小鼠肝和肺病理学检查无明显区别，主要表现为肝组织有轻度的炎症反应，肝小叶中央肝细胞轻度水变性，部分肝窦轻度扩张伴少量淋巴细胞浸润，肺组织有明显的炎症反应变化，肺泡间隔增生，肺泡壁血管轻度扩张伴大量淋巴细胞浸润;所有的组织学结果未见有结核肉牙肿形成、纤维化表现及干酪坏死等严重的结核病理学特征性反应。

　　3 讨论

　　乳头状瘤病毒是一种环状双链结构的 DNA病毒，由7 800～7 900碱基对组成，没有其他病毒所具有的外膜，是一种没有包被的病毒颗粒。其基因结构含有两个开放读码框(ORFs)和一个上游调节区(URR)。ORFs包含6个早期转录单位 (E1，E2，E4，E5，E6，E7，一些 HPV不含 E3，E8)和两个晚期转录区(Ll，L2)。早期转录区主要对染色体外的 DNA复制进行调控，晚期转录区则主要编码病毒衣壳蛋白，L 1区编码主要衣壳蛋白，是主要的种特异性抗原，L2区编码次要衣壳蛋白，是型特异性抗原。上游调节区不编码蛋白，主要通过ORFs调节转录和控制病毒蛋白及感染颗粒的产生。目前公认病毒 DNA整合到宿主细胞基因组中可能是细胞 发生恶变的重要步骤，而E6和E7是两个具有重要转化特性的癌基因[5]。高危型 HPV E6蛋白与野生型P53蛋白具有高度亲和性，二者极易结合使P53蛋白快速降解，从而失去对细胞生长周期的正常调控而引起细胞无限增殖并向恶性转化。HPV E7蛋白通过视网膜母细胞瘤基因(Rb)结合位点，优先与非磷酸化的视网膜母细胞瘤蛋白结合，这种高亲和性使视网膜母细胞瘤蛋白一转录因子复合物解离，转录因子被游离，从而发挥其作用。

　　目前HPV疫苗根据不同用途分为预防型疫苗和治疗型疫苗。预防型疫苗的主要靶蛋白是HPV的壳抗原L1和L2，其目的是激发机体的黏膜系统产生高浓度高亲和力的中和抗体，预防HPV在黏膜的初次感染及自身再次感染。治疗型疫苗主要以HPV的早期基因产物E6、E7作靶蛋白，其目的是诱导机体产生特异性的细胞免疫反应，清除已感染的HPV，预防和治疗由HPV感染引起的癌前病变和肿瘤。自从发现E7为肿瘤排斥抗原以来，E7就一直是研究的焦点，其对细胞的恶性转化及维持其恶性表型具有重要作用，这种作用与其蛋白结构密切相关。乳头瘤病毒16型E7蛋白C末端对于E7蛋白的稳定性有着重要作用，锌指结构区的突变可显著降低E7蛋白的稳定性，加速其降解。大量研究发现，E6、E7原癌蛋白能够激发机体抗肿瘤的细胞毒性淋巴细胞应答(CTL)。因此，将E6、E7蛋 白视作肿瘤特异性抗原，是研究开发HPV疫苗的着眼点之一。在E7蛋白结构与功能研究中亦发现 E7的抗原表位主要集中在C端(39～98位氨基酸)，E7的49～57位氨基酸表位能 诱导细胞毒性T淋巴细胞反应(CTL)，E7的72～98位氨基酸也是CTL识别表位，可激活T细胞介导的免疫应答，而与其转化活性直接相关的区域是E7N端(包括Rb蛋白结合位点22～26位氨基酸和CKⅡ识别位点31～38位氨基酸)。因此本研究选用了N端缺失，保留C端的E7C基因，既可消除E7蛋白的潜在致癌性，又可激活杀伤肿瘤细胞的细胞免疫反应[67]。

　　我们利用基因工程重组技术将E7C基因转入BCG成功构建BCGHPV16E7c疫苗，将该疫苗腹腔内接种清洁级BALB/c鼠，对免疫组小鼠肝和肺组织病理学检查，表明小鼠肝脏有轻度的炎症反应表现为肝小叶中央肝细胞轻度水变性伴少量淋巴细胞浸润，小鼠肺部有明显的炎症反应变化表现为肺泡间隔增生，伴大量淋巴细胞浸润。所有的组织学结果未见有结核肉牙肿形成、纤维化表现及干酪坏死等严重的结核病理学特征性反应，并且和BCG对照组比较未观察到更为严重的病理学变化。因此，初步观察BCGE7c重组疫苗对小鼠无明显的毒性作用，尚需延长观察期做出进一步结论;免疫后第2周和第4周BCGE7c组每只小鼠的血清中均检测到抗E7c特异性抗体，在第4周诱导产生的特异性IgG抗体滴度明显高于第2周，平均滴度为1∶200。说明疫苗能够诱导小鼠产生特异性体液免疫应答;T细胞根据其表面标志及功能特征分为不同的亚群，CD3+CD4+是成熟的辅助/诱导T细胞，具有协助体液免疫和细胞免疫的功能，而CD3+CD8+是成熟的细胞毒性T细胞(CTL)和抑制性T细胞(Ts)的统称，CTL可以特异性的识别和杀伤病毒感染的细胞和肿瘤细胞。从本实验数据的多重比较可以得知：BCGE7c免疫组小鼠CD4+T细胞升高与各对照组比较无明显差异;CD8+T细胞升高明显与各对照组比较差异有统计学意义(P&<0.05)， 表明构建的疫苗能诱导小鼠细胞免疫应答，CD8+T细胞显著升高预示着特异性CTL反应的发生，对于清除HPV病毒及杀伤HPV16相关肿瘤细胞均有意义。

　　总之，本研究组构建的BCGHPV16E7c疫苗能诱导小鼠的体液免疫应答和细胞免疫应答，亦对小鼠无明显的毒性作用。下一步我们将对该疫苗的抗肿瘤效应进行研究，并构建预防性疫苗BCGHPV16L1疫苗以及构建预防和治疗兼备的疫苗HPV16L1E7c重组BCG疫苗，进一步研究疫苗在动物体内的免疫效应和保护效应。

参考文献

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