MICA基因在肾移植中的研究进展

【关键词】 肾移植; MICA; HLA

随着肾移植技术的日趋成熟，现已成为治疗终末肾病最有效的方法。但排异导致的移植肾失功常常成为肾移植失败的最大障碍。移植前后HLA抗体的存在与移植肾排异和失功有关。然而，HLA抗体阴性的移植肾患者同样发生移植肾排异，提示可能有非HLA抗体在超急性、急性和移植肾失功发挥了重要作用。对于HLA抗体阴性的患者，如何确定排异及排异的类型对于排异的控制及预测其预后都是至关重要的问题，而MICA(MHC Class 1 Chainrelated A，主要组织相容性Ⅰ类相关链A位点)抗体在这方面有着明显的应用价值，移植前体内预存MICA抗体不仅是急性排斥的因素之一，而且与移植后慢性排斥和移植肾功能减退相关，清除体内预存的MICA抗体有利于移植成功[1]。近年来，MICA抗体逐渐成为人们研究的热点。本文旨在讨论MICA抗体的特性、检测方法及其临床意义，并就其研究进展进行综述。

　　1 MICA特性

　　1.1 MICA的基因和分子结构

　　1994年首先报道了位于6号染色体的MHC I链相关基因(MIC)[2]。目前，人类MHC基因图谱已经研究确定有7个MIC基因(MICAMICG)，其中只有MICA和MICB编码、表达、转录，MICC， MICD， MICE， MICF和MICG是假基因。MICA和MICB分别位于HLAB着丝粒段46.4 Kb和141.2 Kb。MICA编码383～389个氨基酸的膜结合蛋白，MICB编码383个氨基酸，而且两者有83%的蛋白类似。这些基因编码分子量为62 kd的细胞表面糖蛋白。MICA (11.7 Kb)和MICB(12. 9 Kb)基因的组成分析表明这些基因的长度要比MHC I类分子长，如HLAB。1999年，Spie' s和Roland Strong研究小组通过MICA产物晶体结构的详细分析，推测出MIC分子构象。 X射线衍射和蛋白晶体分子模型分析显示了MICA和经典HLAⅠ分子的相似性和差异性。最显著的差异在于MICA分子α2功能域有一个明显无序的多肽结构，导致在晶体结构中有一个不可见的易弯曲的环(loop)[3]，Loop 结构可能在MICA与其受体结合时发挥重要作用。MICA、MICB位于HLAⅠ类基因区靠近Ⅰ类基因一侧，MIC的区域结构类似于经典HLA-Ⅰ类分子，3个胞外区(α1、α2、α3)、一个跨膜区、一个胞质尾区，但与HLAⅠ类基因同源性较差，仅28%～30%，而MICA、MICB之间同源性有84%。MICs的分子折叠、结构稳定性及其在细胞表面的表达均不需要结合抗原肽，也不需β2微球蛋白的辅助。因为它们是膜结合抗原，并且只表达在缺少β2微球蛋白的细胞表面[4]。其次从晶体结构上看，MICA虽然也有如经典Ⅰ类分子样的α1、α2、α3功能区，但是其空间结构发生了较大变化。虽然α1、α2也可形成抗原结合槽样结构 ，但其仅能容纳小于3～4 个氨基酸残基，这提示MICs不能结合抗原肽。α3与α2、α1间的连接肽易于伸展，从而使各功能区之间更富变动性，这也是MICs 较为独特的性质。

　　1.2 MICA基因的多态性

　　MICA 和 MICB 基因的多态性虽不如经典的 HLAI 类基因丰富，但亦很高，现已发现有 61 个 MICA 等位基因和 30 个 MICB 等位基因[5，6]。如果将来对更多的种族检测，等位基因的数量可能进一步增加，但是有3个最普通的等位基因，分别为MICA*00801 (&>25%)、MICA*00201 (&>10%)、MICA*004 (&>10%)。 Fodil等在 MICA 基因外显子24 (编码胞外结构域 α1α3) 的核苷酸序列中共发现有 27 个核苷酸变异 ， 其中22个是非同义改变 (4/6 在 α1，10/10 在α2，8/11在α3)，在α1α3 中共有16个 MICA 等位基因的变异体 [7] 。MICA 分子多态残基分布在整个分子的胞外部分 ， 但在α2结构域中略有优势。此外 ，日本学者在MICA 基因外显子5( 编码跨膜区)发现了三核苷酸重复顺序(GCT) n微卫星多态性。到目前为止，检测到该微卫星顺序8个独特的等位基因，分别被称为 MICA 的﹡A4、﹡A5、﹡A6、﹡A9、﹡A7、﹡A10、﹡A9.1和﹡A5.1等位基因 [6，8] 。前 6 个分别代表 (GCT) 的重复拷贝数为 4、5、6、9、7、10，﹡ A5.1则是在﹡A5 的基础插入1个G ，即 (GCT)4GGCT。这个(GGCT)序列导致移码突变，在TM区产生一个早期出现的终止密码子，编码一个可溶性的分泌型的 MICA 分子，而﹡A9.1则是在外显子5开始时缺失了1个G，产生一个多态序列和终止密码子。然而一些与MICA等位基因相关的GCT重复还没有证实，而且分型也摸棱两可，仍在进一步研究中。

　　1.3 MICA基因的分子表达

　　MIC基因高度保守，存在于人、灵长类、狗、羊、牛和猪，而小鼠和大鼠不存在。经典的HLAⅠ类分子广泛分布于人体细胞，但MICA 分子表达较局限，大量表达在上皮细胞和成纤维细胞的表面，而在角质细胞、单核细胞表面有少量表达，在外周T、B 淋巴细胞表面不表达。在人体，MICA集中表达在肠道上皮中，其他组织如脑、心脏、肺、胸腺、肝脏、肾脏、皮肤、肾上腺、胎盘、扁桃体和脾脏中都无表达。但目前已经在心、肾和胰腺移植等受体内检出MICA特异性抗体，这说明MICA产物与器官移植存活有关。此外MICA也表达在大多数上皮性肿瘤细胞(胃癌、肠癌、肺癌、乳腺癌、肾癌及卵巢癌等)中。在有些上皮细胞株中，尽管RNA表达的水平相似，但在细胞表面MICA 分子的表达量很低或检测不到，说明MICA 存在不同的翻译后加工和转运途径。Molinero等[9]研究认为，MICA基因翻译起始区存在类似于热休克反应的元件，受到应激后大大增强表达，但受IFNγ刺激后却不能上调表达。而Zou等[10]研究发现接触抑制可以降低成纤维细胞的MICA表达，在成纤维细胞快速生长时可以上调MICA表达。这可能是对损失的一种应激反应，也可能是控制了MICA的RNA和蛋白质的合成关闭或启动，这些需要再进一步研究。目前，Molinero等[6]已经证实类似于HLAⅠ类和HLAⅡ类蛋白，MICA分子也是呈共显性表达，而且MICA抗原的共显性表达对器官移植抗体所产生的免疫反应有重要的意义[11]。

　　在外周血单核细胞中，激活的CD4+和CD8+T细胞能够诱导MICA表达，这一过程涉及多重反应，同时通过TCR/CD3复合物和CD28共同刺激激活胞内途径，这些胞内途径把T细胞的激活和MICA基因的表达联系起来，包括Lck和Fyn激酶的激活，通过MEK1/ERK、P38 MAPK、神经钙蛋白、Jak/STATs和p70s6激酶途径传递信号。所有的T细胞激活还需要其它转录因子如核因子AT、AP1和核因子KB。核因子KB通过P65(RelA)/P50异二聚体和P50/P50同二聚体的复合物调节激活的T淋巴细胞MICA的表达， 推测核因子KB的结合位点在MICA基因的内含子1[9]。

　　1.4 MICA基因的功能

　　最初由于MICA 分子结构域与经典HLAⅠ类相似，人们推测它在多态结合与抗原提呈的某些方面发挥作用，但是这种可能性很快被否定，主要是由于MICA 分子不与β2微球蛋白结合，并且同抗原加工相关转运体(TAP)无关，更直接的证据是人们试图从MICA蛋白上用酸洗脱MICA结合的多肽也没有成功。MICA 的功能是随着其受体NKG2D、与NKG2D 组成复合体DAP10 的发现之后得到明确的。NKG2D 是Ⅱ型C 凝集素样蛋白，编码基因定位在12p12p13。一般情况下，NKG2D 与DAP10 蛋白结合以异二聚体形式存在。人NKG2D 是一种激活性受体，表达于所有自然杀伤(NK)细胞、γδT 细胞、外周的αβCD8 + T 细胞。虽然表达在T细胞表面，但NKG2D的功能是作为共同刺激分子[12]，有些细胞可以直接被NKG2D激活，如NK细胞和人γδT 细胞。NK细胞的活动性是受到激活型和抑制型受体(如NKG2D)的控制，它们的配体(如MICA)表达在可能的靶细胞。正常细胞有许多抑制型受体，在这些细胞是一个负反馈调节机制。当受体的配体减少时如细胞转化或感染或激活型受体的配体表达增加，这些细胞就成为NK细胞介导的杀伤作用的靶细胞。

　　NKG2D受体不仅能够识别MICA而且能够识别其它特异的配体。MICANKG2D复合物在清除感染和癌细胞方面发挥了重要作用[13]。在NKG2D激活后，能触发MICA表达细胞株的细胞毒性反应，清除应激或恶性细胞。然而，MICANKG2D单一结合不能激活胞外细胞毒性的信号，这个过程必需跨膜蛋白DAP10[14]。

　　海南医学院学报 Vol.15 No.4 Apr.2009由于NKG2D 分子的胞质区没有信号转导区域，所以它主要依赖DAP10活性信号的转导。DAP10 分子是PI3 激酶p85 亚单位Sh3 的结合位点，是潜在的Sh3 功能域，可与磷脂酰肌醇3激酶(PI3)的亚单位p85 结合，传递活化信号。由此可以推测，MICA与NKG2D/DAP10 结合后，可以将活化信号传递给NK细胞、γδT 细胞等，可能有助于促进它们对表达MICA 分子的肿瘤细胞和移植物的杀伤，参与天然免疫应答。目前，药物阻断NKG2D产生MICA抗体途径治疗器官移植排异已经进行动物实验[15]，从而为移植器官排异的治疗提供了一个新的途径。

　　2 MICA 抗体的临床意义

　　2.1 MICA抗体与移植肾排异的关系

　　MICA是细胞和体液免疫应答的多态性分子，作为一个多态性抗原，能够诱导移植肾患者产生特异性抗体[16]和体液免疫导致移植肾不可逆的排异[17]。MICA抗体是移植肾排异患者血清中特异性抗体，是肾移植排异的靶分子[17]。因为在移植肾排异时，可以检测到表达在内皮细胞表面的MICA抗原，同时在补体存在的情况下可以杀死靶细胞，也是补体依赖的细胞毒性靶分子[18]。在HLA配型相合的排异肾，MICA抗体和移植肾排异的关系更明显。移植前预存MICA抗体的患者，在移植后的最初3个月移植肾排异将更加普遍。MICA抗体和移植肾排异的关系在第一次移植、没有致敏的HLA抗体、HLA配型完全匹配的移植肾患者中更应关注[19]。目前多篇文献证实MICA抗体和急性排异存在明显相关性[20，21]，而且MICA抗体的持续存在与慢性移植肾失功有关。Amézaga等[22]研究指出，在等待肾移植的患者中检出MICA抗体为24.7%，而在肾移植后的患者中为22.7%，在失功的移植肾灌洗液中，含MICA抗体移植肾占18.7%，这些数据说明错配的MICA等位基因免疫诱导了MICA抗体发展，而在失功的移植肾灌洗液中MICA特异性抗体的发现暗示移植肾排异的发病机制涉及MICA抗体。

　　由于MICA基因表达于上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、激活的单核细胞等细胞，而MICA抗体能够在血清补体存在的情况下杀死靶细胞[23]，所以MICA抗体通过激活补体损伤内皮细胞，继发内皮细胞及平滑肌细胞增生;也可与内皮细胞结合，刺激内皮细胞增殖，从而使血管内膜逐渐增厚，出现特征性的血管腔缩窄，造成移植肾功能进行性的损害，最终出现移植肾功能丧失。另外，MICA抗原在辅助性T细胞的作用下能够产生特异性MICA抗体，MICA抗体被识别并使CD8+T细胞增殖，增殖的CD8+T细胞发挥细胞毒作用，导致移植肾失功[19]。

　　2.2 MICA抗体与移植肾生存率的关系

　　目前已有多篇文献报道，虽然HLA抗体阳性患者会出现移植肾排异，但MICA抗体和HLA抗体同时存在时更容易出现移植肾排异，MICA抗体和HLA抗体之间可能有一定相关性[24]。近来，Panigrahi等[25]对185位活体肾移植患者进行随访后认为，MICA抗体作为独立因子或同时伴有HLA抗体对急性排异的发生率和移植肾的生存率有重要影响。MICA抗体阳性与MICA抗体和HLA抗体均为阴性肾移植患者在急性排异和移植肾生存率方面差异有统计学意义。当MICA和HLA抗体均为阳性时，急性排异发生率最高和移植物生存率最低。这和Mizutani等[26]研究结论基本一致。正是因为MICA抗原具有高度多态性，并且表达在内皮细胞表面，因此，MICA抗原在移植肾排异过程中是个重要的靶分子。

　　MICA抗体可以降低移植肾的生存率[27]。第13届组织相容性工作组对1 329位移植肾有功能的患者进行评估。移植肾4年生存率在MICA抗体阳性患者为81.0%，而HLA和MICA抗体阴性患者为91.4%(P=0.005)。运用生存曲线分析其危险度MICA抗体阳性患者为2.04，这和14届组织相容性工作组得出了相同的结论。1 286位HLA 和MICA抗体阴性患者1年移植物生存率为98.3%，33位 MICA抗体阳性患者为85.8%(P=0.0001)，MICA抗体的存在明显是一个危险因素，危险度达到6.1，同时认为MICA抗体和HLA抗体之间存在明显相关性(P&<0.00002)[28]

　　Eduardo等[11]对196位移植肾患者平均中位随访期为51.4个月(4.3～176.3个月)进行抗体研究[29]。在移植肾生存方面，HLA和MICA抗体阳性患者和阴性患者存在明显区别(P=0.001)，而HLA或MICA抗体之间没有明显差别。此外，这些患者在随访期间最相关的因素之一是在明确抗体类型后要分析肾功能2年。很明显在HLA和MICA抗体阳性患者中肾功能恶化的标志很多，如HLA抗体、MICA抗体、HLA和MICA抗体。这些暗示了表达在移植肾血管内皮细胞的抗体(HLA和MICA)产生双重危害比单一抗体(HLA或MICA)导致移植物更快和更严重的功能恶化。所以，肾移植后不仅要检测HLA抗体而且也要检测MICA抗体，并且MICA抗体成为肾移植患者的预测预后重要标志物，与Terasaki等[27]对移植物生存率的前瞻性研究结果基本一致。故建议肾移植后不仅要检测HLA，而且还要检测MICA抗体，如果检测到了抗体应该检测抗体的特异性和抗体水平，同时检测患者的肌酐水平[29]。

　　目前检测HLA抗体的技术有补体依赖性细胞毒方法(CDC)、普通流式细胞仪(FCXM)、酶联免疫吸附测定方法(ELISA)、免疫磁珠流式细胞仪(Luminex)，而MICA抗体的检测技术有ELISA和Luminex方法。Luminex方法敏感高、特异性强，而且具有重复性好等优点，所以是检测MICA抗体的首选方法，并且首先运用于肾移植患者的MICA抗体检测[23]。目前，Luminex方法可以检测10种MICA等位基因[11]。

　　2.3 MICA抗体与移植肾病理的关系

　　Hankey等[30]用MICA单克隆抗体间接免疫组织化学的方法评估了MIC在肾和胰腺移植活检中的表达。免疫组织化学方法检测表明，全部肾小管坏死或急性排异、大多数的急、慢性排异和慢性排异中有MIC表达，正常肾组织中则没有。在胰腺移植也有同样的结果。这些基因产物的细胞表达和细胞受损相关的条件之间显示了很好的相关性，这些结果可以很好的解释这些分子与细胞应激有关。

　　相反，MICA在Seiler等[31]研究的肾移植中的表达并没有被证实。他们在病理证实的移植肾排异期间观察到NKG2D能诱导许多mRNA。在慢性肾病患者的肾活检中可以检测到高水平的NKG2D转录体，并且比CD3mRNA测量法更高的敏感性和特异性，分析细胞毒性效应的指标以T细胞增殖或颗粒酶B和粒容素mRNA为标志。

　　体液免疫促进移植物排异的发病机制研究前景非常广阔。C4d在管周毛细血管的沉积与体液免疫有关，免疫复合物C4d沉积在管周毛细血管已经证实与移植肾排异相关性非常高[24，32]，而且已经成为Banff97的诊断标准。在一些HLA抗体阴性的排异肾活检中有C4d沉积， 提示MICA抗体可能参与其中[17]。在体外实验中MICA抗体可以激活补体，但在移植肾活检病理中MICA抗体的单独存在与补体C4d在管周毛细血管沉积并不存在相关性，在HLA抗体阴性而MICA抗体阳性移植肾患者中，其排异肾的活检病理所见与补体介导的损伤是一致的[11]。Theruvath等[33] 和Ozawa等 [28]用FK506(它莫昔芬)和骁悉治疗慢性移植肾排异患者时发现可降低C4d的沉积和MICA抗体的滴度，从而稳定了移植肾功能和延缓了移植肾排异。

　　综上所述，MICA抗体是在肾移植排异过程中存在着体液性成分的指标。其检测对于排异的诊断、治疗都有明显的指导意义，且可以预测预后，所以，临床上肾移植患者检测MICA抗体具有很高的实际价值，值得临床推广应用。

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