痤疮丙酸杆菌对小胶质细胞产生TNFα、 IL1β的影响

【摘要】 目的: 探讨痤疮丙酸杆菌（P.acnes）对小胶质细胞产生TNFα、 IL1β的影响， 明确外伤后细菌性致死性肉芽肿(FBGT)致病菌P.acnes临床株、 标准株刺激机体产生细胞因子的差别。方法: 采用ELISA法、 RTPCR的方法观察标准株、 临床株对小胶质细胞产生TNFα和IL1β的影响。结果: (1)P.acnes临床株和标准株均可促进小胶质细胞产生TNFα和IL1β， 与空白对照组相比有统计学意义（P＜0.05）， 标准株较临床株有较强的刺激小胶质细胞产生TNFα的能力; (2)临床株和标准株均能促小胶质细胞进产生IL1β， 二者差别无统计学意义， 但产生IL1β的能力大于TNFα。结论: P.acnes 均可促进小胶质细胞产生TNFα、 IL1β ， 但其能力不同， 说明P.acnes刺激机体早期免疫应答水平不同。

【关键词】 痤疮丙酸杆菌 小胶质细胞 IL1β TNFα

　　外伤后细菌性致死性肉芽肿(fatal bacteria granuloma after trauma， FBGT)是一种继发于面部外伤的慢性感染性致死性疾病［1］， 目前已明确其病原菌为痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes， 简称P.acnes)［2］， 且已证明从患者皮损内分离出的细菌并无变异。P.acnes是一种革兰阳性厌氧杆菌， 属于一种低毒力细胞内寄生菌。FBGT患者均在皮损出现后1.5至4年内死于由P.acnes导致的脑组织炎症。小胶质细胞（microglia， MG ）是重要的免疫细胞， 由其组成一个广泛的防御网， 对神经元具有支持、 营养作用［3］。MG作为脑内的抗原提
呈细胞， 表面有许多细胞因子受体和趋化性细胞因子受体， 可产生多种细胞因子和趋化性细胞因子， 能刺激T细胞活化及增殖， 启动或促进炎症反应在中枢神经系统内的进程［4］。P.acnes如何进入脑内、 为何引起如此凶险的后果等一直是大家关注的问题， 但相关研究目前是一片空白。而且对小胶质细胞产生细胞因子功能的影响尚不明确， 为了明确P.acnes 对单核巨噬细胞产生细胞因子的影响， 我们采用ELISA法、RTPCR法观察P.acnes作用于小胶质细胞后TNFα、 IL1β的产生情况。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　小胶质细胞株［ATCC(CRL2020) ， 购于ATCC］， 以含100 mL/L胎牛血清（中国医学科学院生物工程研究所）的RPMI1640培养液、 IL1βELISA试剂盒、 TNFα ELISA试剂盒购自美国Hyclone公司， 在37℃、 50 mL/L CO2的孵箱中培养并传代; P.acnes标准株(编号:
NCTC 737)由中国科学院微生物所刘志恒教授惠赠: 临床株来自患者皮损的分离; 用厌氧脑心浸液肉汤(BHI) 购自英国Oxiod公司培养。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养

　　小胶质细胞体外培养含100 mL/L胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养， 37℃、 50 mL/L CO2培养。

　　1.2.2 P.acnes 悬液的制备

　　挑取单个菌落接种于厌氧脑心浸液肉汤培养基(BHI)中， 37℃厌氧箱中静止培养， 3 d后， 麦氏比浊法计数， 用生理盐水稀释、 调整细菌密度至1×1011/L， -20℃保存， 使用前室温融化。

　　1.2.3 分组及细胞处理

　　试验分组:按照菌株分为临床株和标准株作为实验组， 生理盐水作为(空白对照组)。细胞处理:收获培养4 d的小胶质细胞， 台盼蓝排除试验证明活细胞率在95%以上。将细胞密度调整为1×109/L， 接种于24孔板， 每孔1 mL， 分别加入各组菌悬液液1 mL， 37℃、50 mL/L CO2孵育24 h ， 800 r/min 离心6 min ， 收集上清， -20℃保存， 使用前室温融化。

　　1.2.4 ELISA法

　　根据说明， 试剂盒平衡至室温(20℃～25℃)， 配制工作液。加入100 μL标准品、 100 μL标本与相应反应孔中， 混匀30 s， 封板， 37℃温育60 min， 洗板(用洗涤液洗涤反应板， 去除水滴， 反复5次)， 每孔加入100 μL生物素， 混匀30 s， 封板， 37℃温育60 min， 洗板5次， 每孔加入100 μL浓缩酶联物， 混匀30 s， 封住板孔， 37℃温育30 min， 洗板5次， 每孔加入显色液100 μL， 37℃暗处温育15 min， 每孔加入终止液100 μL， 30 min内在490 nm处读A值。根据标准品绘制的标准曲线查出其浓度。

　　1.2.5 RTPCR RTPCR分析: 用TRZ提取细胞总RNA， 紫外分光光度仪DU800 测总RNA的浓度及纯度。取1 μg作为RT模板。RT反应体系20 μL， 反应条件按照Invitrogen(SuperScriptTM III reverse ranscriptase)说明书。冰浴后进行PCR。PCR 反应体系25 μL ， TNFα、 IL1β、 GAPDH: 39个循环(95℃ 60 s， 60℃ 60 s， 72℃ 60 s， 最后延伸， 72℃ 7 min)。将PCR产物在10 g/L的琼脂糖凝胶中电泳。RTPCR 引物的设计与合成:依据GenBank中TNFα、 IL1β及GAPDH的基因序列， 设计IL1β， TNFα和GAPDH的3对扩增引物: IL1β正向引物5′TGAACTGAAAGCTCTCCACC3′; 反向引物5′CTGATGTACCAGTTGGGGAA3′; 扩增片段长度为297 bp; TNFα正向引物5′TCAGCCTCTTCTCCTTCCTG3′; 反向引物5′TGAAGAGGACCTGGGAGTAG3′; 扩增片段长度为324 bp; GAPDH正向引物 5
GCCAAGGTCATCCATGACAAC3′; 反向引物5′GTCCACCACCCTGTTGCTGTA3′; 扩增片段长度为498 bp 。并经BLAST验证均具有高度特异性， 由上海生物工程技术服务有限公司合成。

　　1.2.6 统计学处理

　　所测数据用SPSS13.0软件进行方差分析。

　　2 结果

　　2.1 不同菌株对小胶质细胞产生TNFα和IL1β ELISA

　　从表1可见不同菌株作用于小胶质细胞24 h时TNFα、 IL1β表达量的ELISA 结果。可见24 h时， 各菌株作用后TNFα、 IL1β表达量均有明显增加; 标准株刺激后， 小胶质细胞的TNFα表达量高于临床株作用的细胞， 而标准株刺激小胶质细胞胞表达IL1β的量却稍低于临床菌株（表1）。表1 P.acnes作用24 h时小胶质细胞TNFα、 IL1β表达量（略）

　　2.2 P.acnes 悬液对小胶质细胞RTPCR结果

　　从图1可见不同菌株悬液作用于小胶质细胞24 h， 分别在297 bp、 324 bp出现明显条带， 与空白对照有明显差异; 标准株刺激后， 小胶质细胞的TNFα表达量高于临床菌株作用的细胞， 而标准株刺激小胶质细胞表达IL1β的量却低于临床菌株。

　　3 讨论

　　FBGT现已研究表明其病原菌为P.acnes， 该菌为人类常驻低毒力寄生菌， 近年来发现其与很多临床感染性疾病有关［5］。小胶质细胞是重要的免疫细胞， 由其组成一个广泛的防御网， 对神经元具有支持、 营养作用。是脑内天然抗菌免疫系统最重要的细胞之一， 是属于单核吞噬
系统。它具有识别病原菌、 启动抗菌免疫反应， 并且直接参与杀灭病原菌， 调节进一步的免疫反应等关键作用。TNFα、 IL1β是机体内重要的细胞因子， 均由单核细胞、 巨噬细胞产生， 可促进NK细胞和LAK细胞的杀伤水平和黏附分子的表达; 调节淋巴细胞的增殖; 调
Th1P/Th3 细胞的应答; 较强的抗感染、 杀伤或抑制肿瘤细胞、 促炎症活性及免疫调节等多种重要的免疫功能。
　　
　　通过对不同菌株P.acnes细胞悬液作用于小胶质细胞24 h， 产生TNFα、 IL1β的观察发现: 不同P.acnes悬液对小胶质细胞生成TNFα、 IL1β的量与空白对照相比均有明显增加， 不同的是， 标准株产生的TNFα明显高于临床株， 而IL1β的产生却稍低于临床株。用RTPCR方法检验转录水平时 结果大致相同。说明机体对不同P.acnes早期的免疫应答方式或能力不同。有研究表明， P.acnes具有免疫刺激作用［6］， 我们推测， P.acnes在培养过程中产生了某种物质激活了小胶质细胞， 并促进其生成TNFα和IL1β， 从而引起机体的一系列免疫应答反应。近年来， 愈来愈多的研究表明P.acnes是一种条件致病菌， 参与多种疾病的发生， 其中包括多种肉芽肿性疾病 。我们的研究表明， P.acnes可以刺激机体免疫应答， 但不同的菌株可能产生不同的物质， 或者虽产生相同物质但其理化性质发生了改变， 表现出对机体免疫刺激能力不同而导致疾病的发生， 这与文献［7］报道相一致。标准株较FBGT患者临床株有较强的刺激细胞产生TNFα的作用， 提示该病的致病菌和寻常的P.acnes有所不同， 以致疾病迁延不愈。另有文献报道， TNFα可抑制微生物诱导的IL12的表达［8］， 提示患者可能存在某种免疫缺陷， 使致病菌逃避了机体的免疫清除。

参考文献

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