西松烷二萜化合物促进PC12细胞增殖及拮抗谷氨酸损伤的作用

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论文字数：**** 论文编号：lw2023123527 日期：2025-12-10 来源：论文网

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　　　　作者：王东晓，刘屏，任浩洋，林文翰，杨亚青，马晓菲，温烃，廖洪波

【摘要】 目的：观察从软珊瑚（Sinularia flexibilis）中分离得到的西松烷二萜类化合物对PC12细胞增殖及其拮抗谷氨酸兴奋性神经毒损伤的作用，并初步探讨其作用机制。方法：采用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测西松烷二萜类化合物（化合物1、2、3）对PC12细胞增殖活力的影响。用谷氨酸诱导PC12细胞损伤模型，以MTT法检测化合物1、2、3对谷氨酸损伤PC12细胞的保护作用；利用激光共聚焦显微镜检测化合物1对谷氨酸诱导损伤的PC12细胞内钙离子浓度的影响。结果：2、10和50 μmol/L化合物1给药72 h后可使正常PC12细胞光度密（optical density， OD）值显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。谷氨酸损伤24 h后，0.4、2、50 μmol/L化合物1组，0.4、2、100 μmol/L化合物2组以及2 μmol/L化合物3组OD值较模型组显著升高（P＜0.01，P＜0.05）；48 h后，各剂量化合物1组OD值达到正常组和阳性对照组水平，显著高于模型组（P＜0.01，P＜0.05），但未见明显的剂量依赖性。与模型组相比，0.4、2、50 μmol/L化合物1可显著降低谷氨酸损伤PC12细胞内钙离子浓度（P＜0.05，P＜0.01），与阳性对照组作用相当，但未见明显的剂量依赖性。结论：从软珊瑚中分离得到的西松烷二萜化合物1可显著增强PC12细胞增殖活力，化合物1、2、3可促进谷氨酸损伤PC12细胞的恢复，具有明显的促进神经细胞增殖、拮抗谷氨酸兴奋性神经毒损伤的作用，其中新化合物——化合物1作用相对最强，其神经细胞保护作用的可能机制为降低谷氨酸损伤PC12细胞内钙离子浓度，减轻钙超载。

【关键词】 软珊瑚; 西松烷二萜; PC12细胞; 谷氨酸; 钙

　　Methods: Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method was adopted to observe the effects of cembranetype diterpenes (compound 1， compound 2 and compound 3) on the proliferation of PC12 cells. And the protective effects of the three compounds on PC12 cells exposed to glutamate were also detected by MTT. Furthermore， the influence of compound 1 on intracellular concentration of calcium in PC12 cells exposed to glutamate was detected by laser confocal microscopy.

　　Results: After 72hour PC12 cell culture， OD values in the 2， 10 and 50 μmol/L compound 1 groups were significantly higher than that in the normal group (P＜0.05， P＜0.01). After 24hour glutamate damage， OD values in the 0.4， 2 and 50 μmol/L compound 1 groups， the 0.4， 2 and 100 μmol/L compound 2 groups and the 2 μmol/L compound 3 group were obviously increased as compared with the untreated group (P＜0.01， P＜0.05). After 48hour glutamate damage， OD values in the compound 1 group were approximate to those in the normal control and the positive control group while were significantly higher than that in the untreated group (P＜0.01， P＜0.05)， but no dosedependent effect was observed. Compound 1 of 0.4， 2， 50 μmol/L could significantly reduce the intracellular concentration of calcium in PC12 cells exposed to glutamate (P＜0.05， P＜0.01)， which was also approximate to the effect of nimodipine (positive control drug).

　　Conclusion: Cembranetype diterpenes (compound 1， compound 2 and compound 3) extracted from Sinularia flexibilis have obvious protective effects on PC12 cells damaged by glutamate， and compound 1 has the best neuroprotective effect. The mechanism of the neuroprotective effect of compound 1 may lie in reducing the intracellular concentration of calcium in PC12 cells exposed to glutamate and relieving the calcium overload.

　　Keywords: Sinularia flexibilis; cembranetype diterpenes; PC12 cell; glutamate; calcium

　　我国海域辽阔，近20年来，研究者已从海洋生物中发现了许多结构新颖且具有独特生理活性的有机化合物，其中对软珊瑚的化学成分研究一直是非常活跃的领域之一。软珊瑚属于腔肠动物门珊瑚亚纲珊瑚目，是热带海洋常见的动物。文献报道我国南海软珊瑚中含有萜类、甾醇类、鲨肝醇、嘧啶类和含氮化合物等物质，具有明显的生理活性，是重要的药物资源［1］。
　　
　　为了进一步阐明我国Sinularia属软珊瑚的结构多样性及其生物活性，我们对采集自海南三亚的软珊瑚（Sinularia flexiblis）开展了次生代谢产物研究，从其甲醇石油醚提取物中分离得到西松烷型二萜化合物［2］。西松烷二萜属于十四元大环二萜，药理研究表明大多数西松烷型二萜类化合物具有较好的细胞毒和抗肿瘤活性，并具有一定的神经生理活性［3］。本研究采用体外细胞培养技术，观察从软珊瑚（Sinularia flexibilis）中分离得到的3个西松烷二萜类化合物（化合物1、2、3）促进神经细胞增殖的作用，并初步探讨其对兴奋性氨基酸谷氨酸神经毒性的拮抗作用及其机制，为进一步阐明西松烷二萜化合物的药理活性，研发新的神经保护药物奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 实验药物软珊瑚采自南中国海域，经荷兰阿姆斯特丹大学动物博物院Lee P. Van Ofwegen博士鉴定为Sinularia flexibilis，由北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室提供。

　　1.1.2 试剂和仪器大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞，购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。RPMI 1640培养基，为GIBCO公司产品；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），为杭州四季清优级产品；马血清（horse serum， HS），为Hyclone公司产品；甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT），为Amresco公司产品；L谷氨酸和钙离子荧光探针（Fluo3AM calcium），为Sigma公司产品。一次性细胞培养材料（Costar公司），Olympus MK型倒置显微镜（日本Olympus公司），ACAS Ultima型激光扫描共聚焦显微镜（美国Meridian公司），TGL16型离心机（上海医疗器械六厂），CO2培养箱（日本SANYO公司产品）。
　　
　　1.2 实验方法

　　1.2.1 化合物制备将软珊瑚（Sinularia flexibilis， 6.02 kg)乙醇、甲醇提取物（共143.2 g）溶于水后，用石油醚萃取得到石油醚萃取成分（23.78 g），采用高效液相色谱二极管阵列检测器（highperformance liquid chromatography and diode array detector， HPLCDAD）分析其在不同展开剂中的薄层色谱（thinlayer chromatography，TLC）表现，TLC、常压柱色谱技术（常压硅胶色谱和常压凝胶色谱等）、中压色谱技术（中压硅胶色谱和中压凝胶色谱）以及HPLC进一步分离得到化合物1、化合物2、化合物3。经光谱数据分析，化合物2鉴定为(1R， 13S， 12S， 9S， 8R， 5S， 4R)9Acetoxy5， 8: 12，13diepoxycembr15 (17)en16，4olide，化合物3鉴定为sinulariolide，化合物1为新化合物。具体结构式见图1。

　　图1 软珊蝴提取化合物结构式（略）

　　Figure 1 Structure formula of the compounds isolated form Sinularia flexibilis

　　1.2.2 PC12细胞培养 PC12细胞采用RPMI 1640完全培养基培养（补加10%灭活马血清、5%灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素），在37 ℃、5% CO2的孵箱中培养，隔天换液，取对数生长期的细胞用于实验。

　　1.2.3 西松烷二萜化合物1、2、3对PC12细胞增殖的影响待PC12细胞在培养瓶中培养至铺满单层后，经消化、吹打，形成单细胞悬液，倒置显微镜下计数，用RPMI 1640完全培养液将细胞稀释为1×105个/mL。将细胞接种在96孔板中，100 μL/孔，置37 ℃、饱和湿度、5％ CO2培养箱培养24 h后，按分组每孔加入药液10 μL。实验分正常对照组（生理盐水）和实验组（终浓度为0.4、2、10、50、100 μmol/L），每组设6个平行孔。分别培养24、48和72 h后，进行MTT检测。

　　1.2.4 西松烷二萜化合物1、2、3对谷氨酸损伤PC12细胞的保护作用将对数生长期的PC12细胞接种于96孔板中，100 μL/孔（1×105个/mL）。除正常对照组外，其他各组加入谷氨酸10 μL（终浓度为500 μmol/L），建立谷氨酸损伤PC12细胞模型［4］。加入谷氨酸同时，各治疗组分别加入西松烷二萜化合物1、2、3 10 μL（终浓度为0.4、2、10、50、100 μmol/L）；阳性对照组加入尼莫地平10 μL（终浓度为5 μmol/L），每组设6个平行孔。分别培养24和48 h后，进行MTT检测。

　　1.2.5 MTT检测培养结束前4 h，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，37 ℃、5％ CO2继续培育4 h，终止培养，小心吸取孔内培养上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡10 min，使结晶物充分溶解。用DNM9602酶联免疫检测仪（北京普朗新技术有限公司产品）检测570 nm波长处的光度密（optical density，OD）值。

　　1.2.6 西松烷二萜化合物1对PC12细胞内游离钙浓度的影响参照文献方法［5］。将对数生长期的PC12细胞以5×104个/mL细胞密度接种于24孔板内玻片上。除正常对照组外，其他各组加入谷氨酸10 μL（终浓度为500 μmol/L）［4］，给药组加入化合物1药液10 μL（终浓度为0.4、2、10、50、100 μmol/L），阳性对照组加入尼莫地平10 μL（终浓度为5 μmol/L）。每组设6个平行孔。培养24 h后，以无血清培养液冲洗玻片3次，将终浓度5 μmol/L的Fluo3AM探针滴于玻片中央，37 ℃避光孵育30 min，用无血清培养液冲洗后，以激光共聚焦显微镜测定细胞内钙的荧光强度变化。

　　1.3 统计学方法实验数据均用x±s表示，利用Stata 7.0软件，多组间数据比较采单因素方差分析，组间两两比较采用LSDt法，检验水准为α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 西松烷二萜类化合物对PC12细胞增殖的影响与正常对照组相比，培养24 h后，0.4 μmol/L和50 μmol/L化合物1组的OD值明显升高（P＜0.01）；给药48 h后，2 μmol/L和50 μmol/L化合物1组的OD值仍显著高于正常对照组（P＜0.01）；至给药72 h时，随着药物浓度的增加，各剂量化合物1组OD值呈上升趋势，其中2、10和50 μmol/L化合物1组的OD值与正常对照组比较均显著增加（P＜0.05，P＜0.01）。其他各剂量化合物组OD值与正常对照组比较，差异无统计学意义。见表1。

　　2.2 西松烷二萜类化合物对谷氨酸损伤PC12细胞的影响加入谷氨酸后，模型组OD值较正常对照组显著降低，表明谷氨酸对PC12细胞造成明显损伤。给予西松烷二萜类化合物培养细胞24 h后，0.4、2和50 μmol/L化合物1，0.4、2、100 μmol/L化合物2组以及2 μmol/L化合物3组的OD值较模型组显著升高（P＜0.01，P＜0.05）；培养48 h后，各剂量化合物1组OD值均显著高于模型组（P＜0.01，P＜0.05），与阳性药作用相当，但未见明显的剂量依赖性。其他各浓度化合物组OD值与模型组比较，差异无统计学意义。见表2。

　　2.3 化合物1对谷氨酸损伤PC12细胞内钙离子浓度的影响经谷氨酸损伤后，PC12细胞内游离钙离子浓度显著高于正常对照组（P＜0.01），而加入0.4、2和50 μmol/L化合物1后，其钙离子浓度较模型组显著下降（P＜0.05，P＜0.01），与阳性对照组作用接近，但未见明显的剂量依赖性。见图2。

　　表1 西松烷二萜类化合物对PC12细胞增殖的影响（略）

　　Table 1 Effects of cembranetype diterpenes extracted from Sinularia flexibilis on proliferation of PC12 cells

　　*P&<0.05， **P&<0.01， vs normal control group.

　　表2 西松烷二萜类化合物对谷氨酸损伤PC12细胞模型的作用（略）

　　Table 2 Effects of cembranetype diterpenes extracted from Sinularia flexibilis on PC12 cells exposed to glutamate

　　*P&<0.05， **P&<0.01， vs untreated group.

　　图2 化合物1对谷氨酸损伤PC12细胞内钙离子浓度的影响（略）

　　Figure 2 Effects of compound 1 on intracellular calcium concentration in PC12 cell exposed to glutamate

　　A: Normal control group; B: Untreated group; C: Positive control group; DH: Different concentrations of compound 1(0.4， 2， 10， 50 and 100 μmol/L) respectively. Data were represented as x±s， n=6. *P&<0.05， **P&<0.01， vs untreated group.

　　3 讨论
　　
　　近年来，我国珊瑚化学和药理研究发展迅速，发现了一些结构独特并具有强烈生理活性的新化合物，其中结构新颖和生物活性显著的海洋西松烷二萜类活性成分成为大家关注的焦点［1］。目前对西松烷二萜类化合物的活性研究多集中在抗肿瘤方面［6，7］，而对于神经系统的作用研究较少。本研究采用谷氨酸损伤PC12细胞模型，观察从软珊瑚（Sinularia flexibilis）中分离得到的3个西松烷二萜类化合物促进神经细胞增殖、拮抗兴奋性氨基酸对神经细胞损伤的作用，并初步探讨其作用机制，以期为研发新型神经系统保护药物提供先导化合物。
　　
　　离体培养神经细胞是研究神经元损伤和药物作用的理想体外模型［8］。来源于大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤的PC12细胞具有较典型的神经内分泌细胞特征，其细胞形态、结构和功能皆类似于神经细胞，是广泛用于研究神经细胞分化、离子通道、神经毒性的最主要细胞株［9］。本研究中我们采用MTT检测方法，首先观察了从软珊瑚中分离得到的西松烷二萜类化合物1、2、3对PC12细胞增殖的影响。结果表明，给药48 h时，2 μmol/L和50 μmol/L化合物1组的OD值显著高于正常对照组（P＜0.01）；至给药72 h时，其2、10和50 μmol/L组OD值均显著高于正常对照组（P＜0.05，P＜0.01）。提示化合物1可显著促进PC12细胞的增殖，具有明显地促进神经细胞增殖的作用。
　　
　　谷氨酸是人和哺乳动物脑内含量最高的兴奋性氨基酸，参与中枢神经系统的信息传递。但过量的谷氨酸可产生严重的神经兴奋毒性，引起神经元损伤或死亡，在脑缺氧和缺血性损伤、阿尔茨海默病、精神病及神经内分泌紊乱等多种神经疾病的发病中起重要作用［10，11］。本研究中我们进一步建立谷氨酸损伤PC12细胞模型，观察了化合物1、2、3对谷氨酸损伤PC12细胞的保护作用。结果显示，给予谷氨酸后，模型组OD值较正常对照组显著降低，说明谷氨酸对PC12细胞造成了严重损伤。给予西松烷二萜类化合物培养24 h后，0.4、2、50 μmol/L化合物1组，0.4、2、100 μmol/L化合物2组以及2 μmol/L化合物3组OD值较模型组显著升高（P＜0.01，P＜0.05），提示西松烷二萜类化合物对谷氨酸所致的PC12细胞急性损伤具有明显的保护作用；培养48 h后，各剂量化合物1组OD值达到正常组和阳性对照（Ca2+通道拮抗剂尼莫地平）组水平，显著高于模型组（P＜0.01，P＜0.05），但未见明显剂量依赖性，其他各组OD值与模型组比较差异无统计学意义，说明随着损伤后时间的延长，化合物2、3对损伤PC12细胞模型的保护作用逐渐减弱，而化合物1则可显著促进谷氨酸损伤PC12细胞的恢复，表现出了显著的神经细胞保护作用。
　　
　　钙超载是导致神经细胞死亡的“最后共同通路”［12］。PC12细胞同海马等神经细胞一样，细胞膜上含有大量N甲基D天冬氨酸（NmethylDaspartate， NMDA）受体。神经损伤时大量谷氨酸作用于细胞膜上的NMDA受体，引起受体门控钙离子通道开放，导致钙超载被公认为是脑损伤病理过程的主要因素［13］。本研究采用激光共聚焦技术观察化合物1对谷氨酸损伤PC12细胞内钙离子浓度的影响，初步探讨其神经细胞保护作用的可能机制。结果表明，谷氨酸损伤后，PC12细胞内钙离子浓度显著高于正常对照组，出现了钙超载现象，而0.4、2、50 μmol/L化合物1可显著降低谷氨酸损伤PC12细胞内钙离子浓度（P＜0.05， P＜0.01），与阳性对照药——Ca2+通道拮抗剂尼莫地平作用接近，但未见明显的剂量依赖性。提示化合物1的神经细胞保护作用可能与降低神经细胞内Ca2+浓度，减轻钙超载有关。
　　
　　综上所述，从软珊瑚（Sinularia flexibilis）中分离得到的西松烷二萜类化合物1可显著增强PC12细胞增殖活力，化合物1、2、3可促进谷氨酸诱导的损伤PC12细胞的恢复，表现出明显的促进神经细胞增殖、拮抗谷氨酸兴奋性神经毒损伤的作用，其中新化合物——化合物1作用最强，可作为研发新型神经保护药物的先导化合物。推测化合物1降低损伤神经细胞内钙离子浓度，减轻钙超载是其神经细胞保护作用的可能机制之一，但其最佳作用剂量有待进一步研究。

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