作者：姜树原 高丽君 张胜 周立社 邵国
【摘要】 目的:观察重复性低氧对小鼠海马组织内Fas-L蛋白质表达的影响。方法:小鼠低氧0 次(H0)、1 次(H1)、4 次(H4)后取海马组织，应用 Western Blot 技术，检测小鼠海马组织内Fas-L的蛋白表达变化。结果:实验发现H0、H1和H4组海马组织内Fas-L有表达，H4组与H0组之间没有差异，H1组显著升高（P&<0.05，与H0和H1比较）。结论:急性低氧预适应使小鼠海马组织Fas-L表达改变。
【关键词】 低氧预适应;海马;Fas-L
Abstract Objective：To detect the effect of hypoxia preconditioning on Fas-L expression in acute repeated hypoxic mice hippocampus. Methods：Mice were pided into 3 groups randomly and were exposed to hypoxia for 4 runs (H4 group)，1 run (H1 group) and 0 run (control group)，respectively. Western was used to examine the Fas-L level in mice hippocampus after exposure to hypoxia， with total protein extracted from mice hippocampus for Western blot. Results： Fas-L was found in H0， H1 and H4 group. Fas-L protein levels were found to be increased in H1 (P&<0.05， vs.H4 and H0). There is no difference between H4 and H0. Conclusion： The change of Fas-L protein level is closely related to protection of the brain and the formation of preconditioning in hypoxic preconditioned mice.
Key words Hypoxic preconditioning ; Hippocampus ;Fas-L
低氧/缺血是造成脑组织损伤的最常见的临床因素，严重影响人类的健康。脑虽然对低氧/缺血极为敏感，但神经细胞对低氧/缺血有一定的耐受性。1990年Kitagawa等［1］发现脑组织存在低氧/缺血预适应现象，即脑经预先亚致死性的低氧/缺血暴露，可以增强脑对随后致死性低氧/缺血的耐受力。到目前为止其具体机制尚不十分清楚，但脑保护效果却很肯定。
吕国蔚教授上世纪60年代发现小鼠经间断急性重复密闭低氧处理后，对低氧的耐受性随低氧的次数的增加而递增［2］。急性重复密闭低氧引起脑内众多物质发生变化，其中具有脑保护作用的一些物质发生上调，而具有脑损伤作用的物质发生下调［3］。Fas-L是调节细胞凋亡的重要分子，有“死亡分子”之称，但其在急性重复低氧预适应中的作用尚无报道。本工作研究Fas-L表达在急性重复低氧小鼠海马中的变化，探讨急性重复低氧预适应形成脑保护过程中神经细胞凋亡的情况。
1 材料与方法
1.1 动物模型复制
Bal b/c近交系雄性小鼠，6～8周龄，体重18～22g，属清洁级动物，由军事医学科学院提供。按以前报道复制模型［3］， 即将小鼠置于含有新鲜空气、经过标定的150mL 广口瓶内，以橡皮塞密闭，记时。动物一旦出现喘呼吸（低氧耐受极限标志），立即取出，转移到另一相同体积、含有新鲜空气的广口瓶内，密闭，记录低氧耐受时间，依此类推共进行4次低氧实验。实验分H0、H1、H4三组，H0为正常对照组，H1为低氧1次组，H4为重复低氧4次组。随后立即断头取脑，剥离海马。
1.2 Western Blot
将海马置冻存管液氮冻存，然后移入裂解液中，用超声粉碎仪匀浆，用BCA法进行总蛋白定量，加入5×上样缓冲液，配制样品，100℃加热10min变性。从上述各组样品中分别取75μg的总蛋白上样，用8%SDS-PAGE、4℃、20mA电泳，当指示剂溴酚蓝电泳到分离胶时调节电流为30mA继续电泳3.5h；随后立即于4℃、400mA条件下通过湿转法将蛋白从SDS-PAGE胶上转移到硝酸纤维素（NC）膜上，转膜5h；将NC膜用TBS(10mmol/L Tris-Cl， pH7.5， 250mmol/L NaCl )振摇漂洗10min，10%脱脂牛奶封闭1h，再用TTBS(10mmol/L Tris-Cl， pH7.5， 250mmol/L NaCl， 0.25% Tween-20)振摇洗膜3次，每次10min；NC膜与用TTBS稀释的Fas-L多克隆抗体（1∶500）或β－actin单克隆抗体（1∶400）常温下孵育4h，用TTBS洗膜，方法同上，再与用TTBS稀释的二抗孵育1h， TTBS洗膜，方法同上；ECL试剂1∶1混合与膜反应均匀，约5min。在暗室中与X光片曝光5～20min，再将胶片置于显影液和定影液各2min后观察。
1.3 统计学处理
结果以x±s 表示， 用SPSS10.0 数据统计软件ANOVA 和Tukey 对组间数据进行处理和分析，以P&<0.05 为检验水准。
2 结果
2.1 不同低氧次数对小鼠耐受时间的影响见图1，由图可见随低氧次数的增加小鼠的低氧耐受性增强。
2.2 Western blot结果表明，Fas-L在 H0、H1和H4组中均有表达，以β-actin为内参，计算各组蛋白质的相对丰度值。H0、H1和H4组Fas-L的相对丰度分别为0.86±0.10、1.13±0.21、0.91±0.16（n=5）。Fas-L蛋白在低氧后增加，低氧预适应后又向基础水平回落，见图2、图3。
3 讨论
低氧/缺血可以影响神经细胞的正常生理功能，严重时会造成神经细胞的死亡。低氧/缺血条件下在非神经细胞中表达的死亡诱导配体（death-inducing ligands，DILs）都涉及到细胞凋亡过程，DILs包括Fas-L (APO-1L/ CD95-L)、肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体(TRAIL/APO-2L)以及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等［4］。Martin-Villalba等［5］研究显示成年大鼠脑缺血后Fas-L表达使神经细胞凋亡，抑制其表达则可以有助于细胞的生存。Fas是细胞表面的蛋白受体分子，是肿瘤坏死因子受体超家族成员之一，Fas-L是TNF家族Ⅱ型膜蛋白，Fas与Fas-L相互作用，将凋亡信号引入细胞内，激活caspase信号系统，引起细胞凋亡。
小鼠通过急性重复低氧可以在短时间内获得预适应，其低氧耐受时间随低氧次数的增加而增加。在重复低氧过程中，脑中一些化学物质的活性或含量以及气体/能量代谢都发生了变化［6-7］，进而维持细胞生存。在此过程中，脑损伤物质如兴奋性氨基酸（谷氨酸等）下调［3］。而Fas-L是已经明确参与神经细胞凋亡的分子，如其表达下调，对于神经细胞生存有重要作用。
本研究发现三组小鼠海马组织中都检测到Fas-L，本实验观察到H1组小鼠海马组织内Fas-L水平较H0组和H4组显著增加，而H4组又向基础水平回落。有文献报道正常条件下大脑中检测不到Fas-L［5］，与本研究中H0中可以检测到Fas-L结果不同，而Minogue等［8］研究结果则与本报道相同，即常氧条件可以检测到Fas-L。大量研究显示，低氧/缺血可以增加Fas-L表达，与本实验H1组结果相一致。而低氧预适应组海马组织中Fas-L没有因为低氧次数增加而增加，相反其蛋白量与H0组之间没有显著差异。我们先前研究大脑皮层细胞线粒体超微结构发现，H1组使线粒体发生肿胀，而H4组使线粒体的结构又得到恢复［9］。因此由Fas-L和线粒体亚显微结构变化可知，低氧预适应形成的脑保护抑制神经细胞凋亡，Fas-L降低可能是预适应形成并参与脑保护的重要环节。
低氧/缺血预适应是个复杂的细胞和组织过程，具有保护作用的分子如VEGF的上调及具有损伤作用的物质如Fas-L下调对生物个体的生存是至关重要的［10］。低氧/缺血细胞应急应答中涉及c-Jun N末端激酶/应急激活蛋白激酶（stress-activated proteinkinases ，JNK/SAPKs)活化。随后JNK/SAPKs转位进入核内通过磷酸化激活c-Jun转录因子，进而诱导c-Jun/AP-1靶基因表达，Fas-L即为其靶基因之一。本研究只探讨了低氧预适应对Fas-L的影响，要进一步明确Fas-L的变化原因，需对JNK/SAPKs信号通路做深入研究，通过揭示低氧预适应可能机制将对高原医学、运动医学和航天医学做出贡献。
参考文献
［1］Kitagawa K， Matsumoto M， Tagaya M， et al.“Ischemic tolerance” phenomenon found in the brain［J］. Brain Research， 1990， 528：21-24.
［2］潘世崴.低氧适应的组织机制//病理生理科学进展(一)［M］.北京:人民卫生出版社，1963：169-273.
［3］Lu GW， Yu S， Li RH， et al. Hypoxic preconditioning: a novel intrinsic cytoprotective strategy［J］. Mol Neurobiol， 2005， 31(1-3): 255-271.
［4］Nagata S. Apoptosis by death factor［J］. Cell， 1997， 88: 355-365.
［5］Martin-Villalba A，Hell L，Jeremias L， et al. CD95 ligand(Fas-L/APO-1L) and tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand mediate ischemia-induced apoptosis in neurons［J］. J Neurosci， 1999， 19 (10): 3809-3017.
［6］Lu GW， Liu HY. Downregulation of nitric oxide in the brain of mice during their hypoxic preconditioning［J］. J Appl Physiol， 2001，91:1193-1198.
［7］Lu GW， Cui XY， Zhao BM. Alteration of oxygen consumption and energy metabolism during repetitive exposure of mice to hypoxia［J］. Neurochem Res，1999，24: 625-628.
［8］Minogue AM， Schmid AW， Fogarty MP， et al. Activation of the c-Jun N-terminal Kinase Signaling Cascade Mediates the Effect of Amyloid-βon Long Term Potentiation and Cell Death in Hippocampus［J］. JBC，2003，278：27971-27980.
［9］李江，吕国蔚.急性重复低氧小鼠脑皮质神经元的超微结构研究［J］.华北煤炭医学院学报，2002，4（5）：548-549.
［10］Shao G， Gao CY， Lu GW. Alterations of hypoxia-inducible factor-1 in the hippocampus of mice acutely and repeatly exposed to hypoxia［J］.Neurosignals，2005，14(5):255-261.