PtenL/LMEFs与Pten△/△MEFs细胞系的差异表达蛋白质组分析段

【摘要】 目的 研究PtenL/LMEFs与Pten△/△MEFs细胞的蛋白表达差异。方法 运用双向电泳技术比较PtenL/LMEFs与Pten△/△MEFs细胞的蛋白表达差异，6个差异蛋白进行胶内酶切后运用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDITOFMS)进行质谱分析，肽质量指纹图谱检索数据库后5个蛋白得到鉴定。结果 同对照PTEN野生型细胞PtenL/LMEFs相比，磷酸甘油酸变位酶1(phosphoglycerate mutase 1， PGAM1)和肽脯氨酰顺反异构酶C(peptidylprolyl cistrans isomerase C， cyclophilin C)在Pten△/△MEFs细胞中表达上调而Transgelin 2蛋白在Pten△/△MEFs细胞中表达下调。经鉴定已知蛋白点B和F都是过氧化物氧化还原酶6(Peroxiredoxin6)，蛋白点B在Pten△/△MEFs细胞中表达而在Pten△/△MEFs细胞中检测不到，蛋白点B和F的分子质量相似而等电点不同，可能是由于翻译后修饰。结论 同对照PTEN野生型细胞PtenL/LMEFs相比，PTEN缺失的Pten△/△MEFs细胞有明显的差异性蛋白表达谱。PTEN的缺失引起细胞内多种蛋白表达改变，这些表达改变的蛋白可能与PTEN缺失后细胞癌变相关。

【关键词】 PTEN 双向电泳 基质辅助激光解 电离飞行时间质谱 肽质量指纹图谱

　　ABSTRACT: Objective To study protein variation between PtenL/LMEFs and Pten△/△MEFs cells. Methods Twodimensional electrophoresis (2DE) was employed to compare the differential expression proteins between PtenL/LMEFs and Pten△/△MEFs cells. Six differential expression proteins were digested in gel by enzyme and the mass of generated peptides was measured by matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDITOFMS). The data obtained from peptide mass fingerprinting (PMF) were searched using the Internet available database and five proteins were identified. Results Compared with that of PtenL/LMEFs， expression level of proteins including phosphoglycerate mutase 1 (PGAM1) and peptidylprolyl cistrans isomerase C (PPIC) was upregulated， whereas expression level of Transgelin 2 was downregulated in Pten△/△MEFs cells. B and F proteins were both identified to be peroxiredoxin6. They had similar molecular weight but different PI which might be caused by posttranslation modification. B protein was only expressed in Pten△/△MEFs cells. Conclusion The protein profile of Pten△/△MEFs cells displayed obvious difference compared to that of PtenL/LMEFs cells. The results implied that various distinct different proteins might lead to cancer.

　　KEY WORDS: PTEN; twodimensional electrophoresis (2DE); matrix assisted laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry; peptide mass fingerprinting

　　第10号染色体同源缺失性磷酸酶张力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten， PTEN)是第一个被发现的其产物具有磷酸酶活性的抑癌基因，它通过负调控多种信号转导途径包括PI3K/Akt途径、FAK途径和MAPK途径调节细胞生长、增殖、生存及转移。研究发现PTEN在多种肿瘤中存在缺失或突变 [12]。培育PTEN基因敲除小鼠及细胞系是研究PTEN基因功能的最重要的手段。永生化的小鼠胚胎成纤维细胞系PtenL/LMEFs细胞和PTEN基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞系Pten△/△MEFs是研究PTEN功能的理想体外细胞模型。Pten△/△MEFs细胞的建系方法：首先培育并永生化来自PtenloxP/loxP小鼠的胚胎成纤维细胞(PtenL/LMEFs细胞)，此小鼠的Pten基因的外显子5两旁各插入一段loxP序列，但Pten的转录不受影响，因此PtenL/LMEFs细胞可作为Pten表达正常的对照细胞；此细胞系在体外条件下被瞬时转染Cre重组酶，Cre重组酶可识别并剪切由loxP序列所标记的序列，经过筛选而获得Pten缺失的细胞系Pten△/△MEFs[3]。Freeman等[3]利用以上细胞系研究了PTEN对p53的作用，提出了PTEN同p53相互作用的新机制：PTEN可同p53直接物理性结合，影响p53结合DNA的能力，调控p53的转录活力。Chang等[4]利用以上细胞系的研究发现PTEN通过Mdm2的P1启动子调节Mdm2的表达。Li等[5]利用以上细胞系的研究发现一种分泌性的生长因子Pleiotrophin在PTEN缺失后表达上调，抑制该蛋白的表达后PTEN缺失细胞的生长和致瘤能力降低。为了更好地了解PTEN调控细胞功能的机制，本研究应用蛋白质组技术比较了PtenL/LMEFs与Pten△/△MEFs细胞系的蛋白质表达谱，鉴定出一些差异表达的蛋白，为阐明PTEN调控细胞功能的机制提供了新的线索。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 PtenL/LMEFs细胞系和Pten△/△MEFs细胞系由美国加州大学洛杉基分校Hong Wu博士馈赠，本实验室保存；IPG干胶条(pH 3-10，18cm)，蛋白定量试剂盒(2D Quant Kit)购自Amersham Pharmacia公司；蛋白酶抑制剂(Protease inhibitor cocktail tablet)购自Roche公司；低分子量标准购自Promega公司；Trisbase购自Sigma公司；PTEN/AKT信号转导通路检测试剂盒购自Cell Signaling公司(含磷酸化PTEN多克隆抗体、AKT多克隆抗体、磷酸化AKT473多克隆抗体、磷酸化AKT308多克隆抗体、磷酸化GSK3β多克隆抗体，均为兔抗小鼠的多克隆抗体)；山羊抗小鼠PTEN多克隆抗体、荧光显色试剂购自Santa cruz公司，HRP标记的兔抗山羊多克隆抗体购自中山生物试剂公司；PVDF膜购自Biorad公司；等电聚焦仪为EttanTM IPGphorTM(Amersham Pharmacia)；垂直板电泳仪为Protean Ⅱ Xi(BioRad，美国)；质谱仪为Reflex Ⅲ MALDITOF MS(Bruker)。

　　1.2 细胞培养和蛋白样品制备 PtenL/LMEFs和Pten△/△MEFs细胞按常规方法培养，用含100mL/L胎牛血清，终浓度为100u/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养液，置于37℃、50mL/L CO2培养箱中恒温恒湿培养；当细胞达到指数增长期后，胰酶消化细胞并用PBS缓冲液洗涤3遍；1×107个细胞中加入100μL的裂解缓冲液(8mol/L尿素，40g/L CHAPS，40mmol/L Trisbase)并加入蛋白酶抑制剂，用超声仪超声裂解细胞；加入10μL RNA酶(10μg/μL)，4℃放置30min，4℃ 12000r/min离心15min去除不溶性沉淀；取上清用蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度，按照每管1mg分装，-70℃保存备用。

　　1.3 双向电泳 参照文献[7]进行。分别在1mg PtenL/LMEFs和Pten△/△MEFs细胞蛋白样品中加入溶涨液(8mol/L尿素，20g/L CHAPS，体积分数为0.5% pH 3-10 IPG缓冲液，20mmol/L DTT和极少量的溴酚蓝)定容至350μL，充分混匀。用18cm IPG胶条(pH 3-10)于20℃在IPGphor(Amersham Pharmacia Biotech)上等电聚焦(每个胶条在30V电压下聚焦6h，500V电压下聚焦1h，1000V电压下聚焦1h，8000V电压下聚焦5h，每个胶条电流不超过50μA)。胶条经2次平衡后，在垂直胶电泳系统(BioRad protean Ⅱ Xi， BioRad laboratories)上用125g/L的SDSPAGE进行双向分离。电泳完成后，用考马斯亮蓝G250染色液过夜染色，用10mL/L冰乙酸脱色。

　　1.4 图像扫描和分析 用ImageScanner扫描仪扫描，用PDQUEST 7.0软件进行图像分析。

　　1.5 胶内酶切 切取胶上的蛋白质点，用50μL脱色液(25mmol/L碳酸氢氨+体积分数为50%乙腈)于室温脱色至胶块无色。真空离心后加入2μL溶于20mmol/L碳酸氢氨的胰蛋白酶(10ng/μL，Roche测序级)，4℃吸涨1h后37℃作用10-12h。加入8μL体积分数为5%三氟乙酸，37℃温育1h，将液体吸净，移至干净的离心管中。再加入8μL溶液(体积分数为2.5%三氟乙酸+体积分数为50%乙腈)，30℃温育1h，吸出液体，与前一次的抽提物合并。真空离心干燥肽段提取液，用2μL溶液(体积分数为0.5%三氟乙酸+体积分数为30%乙腈)充分溶解肽段，进行质谱鉴定。

　　1.6 MALDITOF质谱鉴定及数据库检索 基质为溶于体积分数为0.1%三氟乙酸/体积分数为50%乙腈的饱和α氰基4羟基肉桂酸，利用Reflex Ⅲ MALDITOF MS质谱仪(Bruker)在加速电压为20kV，反射电压为23kV的条件下进行MALDITOF MS测定。质谱数据利用Bruker的标准肽段或胰蛋白酶自裂解片段进行校正。将质谱所测肽质量指纹图谱数据输入互联网上的Mascot数据库(http://www.matrixscience.com)进行检索。检索时，物种选择小鼠，可接受的肽段相对分子质量误差为0.4ku，固定修饰方式(fixed modifications)选择Carbamidomethyl(C)，可变的氨基酸修饰方式(Variable modifications)选择Oxidation(M)，Max missed cleavage为1，最少匹配肽段4个。分值大于54为检索结果具有统计学意义(P<0.05)。

　　1.7 Western印迹 提取细胞总蛋白质，取100μg上样行100g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜。50g/L脱脂奶粉室温封闭膜2h，一抗4℃孵育过夜。所用一抗分别是：PTEN多克隆抗体、磷酸化PTEN多克隆抗体、AKT多克隆抗体、磷酸化AKT473(PAKT473)多克隆抗体、磷酸化AKT308(PAKT308)多克隆抗体、磷酸化GSK3β多克隆抗体。用HRP标记的第二抗体室温孵育2h后，发光底物显迹法进行显迹，经显影、定影后分析杂交信号，并以同一张膜上重复杂交β肌动蛋白(ACTIN)作为对照。

　　2 结果

　　2.1 Western blot检测结果 Western blot检测证实PTEN在PtenL/LMEFs中表达水平较高且有磷酸化的PTEN(PPTEN)存在而在Pten△/△MEFs细胞中检测不到PTEN和PPTEN蛋白(图1)，表明细胞系PtenL/LMEFs正常表达PTEN蛋白，而Pten△/△MEFs细胞PTEN蛋白表达缺失。PTEN/AKT信号转导通路中关键分子的蛋白表达检测发现：PTEN缺失后细胞内AKT在473位和308位的磷酸化水平均显著增加，GSK3β磷酸化水平增加(图2)。

　　图1 Western blot 检测PtenL/LMEFs和Pten△/△MEFs细胞中PTEN和PPTEN蛋白的表达（略）

　　Fig.1 Expression of PTEN and PPTEN in PtenL/LMEFs and Pten△/△ MEFs cells

　　2.2 PtenL/LMEFs和Pten△/△MEFs细胞的蛋白质双向电泳图谱分析 PtenL/LMEFs和Pten△/△MEFs细胞总蛋白质双向凝胶电泳重复3次，代表性图谱如图3和图4所示。用PDQUEST 8.0.1软件分析蛋白图谱。每张电泳图显示约900个蛋白点。对差异表达的蛋白点A、B、C、D、E和F(图3、图4)进行质谱鉴定。

　　图2 Western blot 检测PtenL/LMEFs和Pten△/△MEFs细胞中PTEN/AKT信号转导通路中关键蛋白的表达（略）

　　Fig.2 Expression of key moleculors of PTEN/AKT signal transduction pathway in PtenL/LMEFs and Pten△/△MEFs cells

　　2.3 双向凝胶差异蛋白点的肽质量指纹谱鉴定 对差异表达的蛋白点A、B、C、D、E和F进行MALDITOFMS测定肽质量指纹谱。通过Mascot搜寻软件直接上网(http://www.matrixscience.com)进行搜寻，查询结果见表1。除D蛋白由于检测分值(protein score)小于54，其余的蛋白检测结果都有意义。

　　图3 PtenL/LMEFs(A)和Pten△/△MEFs(B)细胞的2DE双向凝胶图谱（略）

　　Fig.3 Twodimensional electrophoretic (2DE) maps of PtenL/LMEFs(A) and Pten△/△ MEFs(B) cells

　　图4 PtenL/LMEFs和Pten△/△MEFs细胞的双向电泳凝胶的局部图，箭头所指的蛋白在两个细胞中差异表达（略）

　　Fig.4 Segments of twodimensional gels of PtenL/LMEFs and Pten△/△MEFs cells. Arrowed are six protein spots that are differentially expressed

　　表1 PtenL/LMEFs和Pten△/△MEFs细胞中6个差异表达蛋白进行质谱鉴定，通过在SWISSPROT 数据库中检索肽质量指纹图谱数据，5个蛋白得到鉴定（略）

　　Table 1 Six differentially expressed proteins in PtenL/LMEFs and Pten△/△MEFs cells were analyzed with MALDITOF MS and five proteins were identified by PMF searching in SWISSPROT database

　　*Protein score is -10×Log(P)， where P is the probability that the observed match is a random event; Protein scores greater than 54 are significant (P<0.05);“↓”downregulated proteins in Pten△/△MEFs cells; “↑”upregulated proteins in Pten△/△MEFs cells

　　3 讨论
　　
　　PTEN蛋白是双重底物特异性磷酸酶，具有脂磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性。PTEN蛋白主要通过它的脂质磷酸酶活性对PI3K途径起着负调控的作用。PTEN缺失导致3，4，5，三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)水平上升，PIP3的聚集引起各种蛋白激酶的活化，包括PDK1和PKB/AKT丝/苏氨酸激酶。AKT是PTEN调控途径中的关键分子，AKT的丝氨酸-473和苏氨酸-308位点磷酸化后使AKT激活，参与细胞的转录、翻译，抵抗凋亡。PI3K/AKT是重要的信号通路，AKT能够通过磷酸化它的底物从而导致细胞周期进程的加速、促进细胞生长、存活、迁移、血管生成、蛋白合成和糖原代谢等[6]。PTEN蛋白是脂质磷酸酶，能使PIP3脱磷酸，阻断PI3K/AKT通路。如果PTEN蛋白失活，PI3K/AKT持续活化，将导致细胞分裂、体积增大、凋亡阻滞和肿瘤血管生成等[7]。本研究发现PTEN缺失细胞Pten△/△MEFs中AKT蛋白在其473位和308位的磷酸化水平明显升高，说明PTEN的缺失导致AKT的激活(图1、图2)。GSK3β是AKT调控的重要底物之一。研究发现GSK3β的磷酸化水平在PTEN缺失后水平升高(图2)。GSK3β被AKT磷酸化后，其活性受到抑制，将导致Cyclin D1上GSK3β作用位点的磷酸化程度降低，进而阻滞Cyclin D1的蛋白降解，促进细胞增殖[8]。
　　
　　本研究应用蛋白质组技术比较了PtenL/LMEFs与Pten△/△MEFs细胞系的蛋白质表达谱，PtenL/LMEFs与Pten△/△MEFs细胞系的电泳图各显示约900个蛋白点(图3)。质谱鉴定了差异表达的蛋白中的6个蛋白，经数据库的检索5个蛋白点得到确认，它们分别是磷酸甘油酸变位酶1(phosphoglycerate mutase 1， PGAM1)、肽脯氨酰顺反异构酶C(peptidylprolyl cistrans isomerase C， cyclophilin C)、Transgelin 2和过氧化物氧化还原酶6(Peroxiredoxin6)蛋白，其中蛋白点B和F经检索得知它们都是过氧化物氧化还原酶6(表1)。
　　
　　小鼠的肽脯氨酰顺反异构酶C 即Cyclophilin C属于Cyclophilin家族。Cyclophilin (CyP)即环孢素A结合蛋白，是环孢素A(CyclosporinA，CsA)的细胞内蛋白受体。Mi等[9]发现Osteopontin的COOH(-)末端片段与另一细胞转移功能的标志蛋白Cyclophilin C作用并结合到CD147细胞表面糖蛋白上，从而激活AKT1/2和基质金属蛋白酶2。体外分析实验中，在Cyclophilin C存在时Osteopontin的COOH(-)末端片段促进4T07和4T1细胞的迁移和浸润。Nabeshima等[10]报道Cyclophilin(A，B，C，D)的过表达及其与CD147蛋白的相互作用与胰腺癌、乳腺癌及非小细胞肺癌细胞的增殖、转移能力的增强有关。这些实验结果表明Cyclophilin C在细胞内发挥着重要的作用。Cyclophilin C在Pten△/△MEFs细胞表达上调，它在PTEN缺失后的细胞中的功能还有待进一步的研究。
　　
　　小鼠Transgelin 2与SM22β基因都编码同一个199个氨基酸的蛋白，分子质量约为22.4ku，小鼠SM22β与小鼠SM22α蛋白的氨基酸序列有68%的同源性。在平滑肌细胞中小鼠SM22β与小鼠SM22α蛋白共定位于actin肌丝蛋白上[11]。含有突变的SM22α基因的小鼠其含有平滑肌细胞的组织及动脉、静脉的组织学或超微结构没有明显的改变，说明在平滑肌细胞中可能存在与SM22α一起表达的其他蛋白可能能够代替其基本的功能，SM22β可能就是该类蛋白[1112]。Gabr等报道大鼠气管内滴入肝素后24h将引起DJ1/PARK7蛋白的显著上调和Transgelin 2(TAGLN2)显著下调。DJ1/PARK7蛋白是PTEN蛋白的负调控蛋白，也是肿瘤潜在的标志物[13]。这提示PTEN的抑制与Transgelin 2(TAGLN2)的下调可能有关。Transgelin 2在Pten△/△MEFs细胞表达下调，Transgelin 2同PTEN的关系及其在肿瘤发生中的作用值得深入研究。
　　
　　PGAM1是一种参与糖酵解的酶，可能在肿瘤细胞的代谢和增殖中起作用。最近的研究表明，肿瘤细胞的生存有赖于糖酵解途径，PGAM1 可作为潜在的肿瘤治疗的新靶点 [14]。Chen等[15]报道PGAM1在肺腺癌组织中高表达且与不良预后有关。PGAM1在Pten△/△MEFs细胞表达上调，它在PTEN缺失后细胞的代谢和增殖中的作用值得进一步研究。
　　
　　Peroxiredoxin6蛋白是一种抗氧化蛋白，起细胞保护作用。在Pten△/△MEFs细胞中表达的两个蛋白点B和F经质谱鉴定和数据库检索发现它们都是Peroxiredoxin6蛋白，B点在PtenL/LMEFs细胞中检测不到(图3、图4)，提示Peroxiredoxin6蛋白在Pten△/△MEFs细胞中可能发生了翻译后修饰，其意义值得研究。
　　
　　通过比较蛋白质组学的研究，我们发现PTEN缺失的小鼠胚胎细胞系Pten△/△MEFs细胞与PTEN表达正常的对照小鼠胚胎细胞系PtenL/LMEFs细胞在蛋白表达水平上存在明显差异。已经鉴定的差异性蛋白质涉及细胞的代谢、氧化应激、侵袭转移、信号传导等细胞生物学过程。进一步研究它们在PTEN缺失后细胞癌变过程中的作用，这对深入阐明肿瘤发生机理及寻求抗肿瘤新靶点具有重要意义。

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