KCNE2蛋白在自发性高血压大鼠心脏组织中的分布和表达

　　　　 作者：王慧莲，吕社民，宁启兰，韩燕，杨旭东，钟波

【摘要】 目的 研究KCNE2蛋白在自发性高血压大鼠(SHR)心脏不同部位的分布和表达差异，及鼠龄对其表达水平的影响。方法 提取幼龄和高龄SHR心肌不同部位(心室、室隔膜和心房)组织的膜蛋白，利用Western印迹技术和图象分析方法，比较KCNE2蛋白在样品之间免疫强度差异。结果 SHR心肌不同部位组织中均有KCNE2蛋白的分布；同龄大鼠心肌不同部位组织中KCNE2蛋白的表达均无显著性差异；但在高龄大鼠的右心室和室隔膜组织中，KCNE2蛋白的表达显著高于其在幼龄大鼠相同组织中的表达。结论 KCNE2蛋白在SHR心脏不同部位均有分布；在高龄大鼠右心室和室隔膜组织中，KCNE2蛋白的表达水平均高于其在幼龄大鼠同一组织中的表达。

【关键词】 KCNE2；自发性高血压大鼠；Western印迹法

　　ABSTRACT: Objective To investigate the distribution and expression of KCNE2 in different parts of myocardium of spontaneously hypertensive rats (SHR) and compare differences of KCNE expression in cardiac muscle between young and old SHR. Methods First membrane proteins were prepared from right ventricular myocardium(RV)， interventricular septum， left ventricular myocardium(LV) and atrial myocardium from young and old SHR， respectively. Then the membrane proteins were separated by SDSPAGE， transferred to polyscreen PVDF membrane， probed with a primary antiKCNE2 (polyclonal Ab)， and visualized with ECL detection kit. Images were acquired and analyzed with related software. Results KCNE2 protein was found to distribute in all different parts of myocardium of SHR with no significant differences. The expression of KCNE2， however， in right ventricular and interventricular septum of old rats was significantly higher than that of young rats. Conclusion KCNE2 protein distributes in all different parts of myocardium of SHR. The expression of KCNE2 in right ventricular and interventricular septum of old rats is significantly higher than that of young rats.

　　KEY WORDS: KCNE2; spontaneously hypertensive rat; Western blot

　　KCNE2蛋白也称MiRP1(minkrelated protein 1)蛋白，是一个含有123个氨基酸、具有一个跨膜结构域的蛋白[1]。KCNE2蛋白是几个电压门离子通道的β亚基，可与多个离子通道的a亚基如HERG通道、kv4.2通道、KCNQ1通道和超极化激活的阳离子通道相互作用，调节和影响着这些离子通道的功能[13]。KCNE2蛋白很可能是心脏电生理的一个重要的调控子[2]，该亚基可以和HERG通道的α亚基或/和KCNQ1亚基联合聚集形成传导IKr(快激活钾延迟整流电流)和/或IKs(慢激活钾延迟整流电流)的通道[45]。
　　
　　自发性高血压大鼠(SHR)是高血压和心血管病研究的常用动物模型 [67]。资料表明，心脏组织的细胞膜钾通道各亚基的分布和表达水平对心脏电生理的功能有一定的影响和调控作用[8]。目前尚未见有关KCNE2蛋白在SHR心脏各部位组织中的分布和表达方面的研究报道。本研究以幼龄和高龄SHR心脏为实验材料，旨在探讨KCNE2蛋白在SHR心脏不同部位的分布和表达情况以及鼠龄对其表达的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 SHR购于第四军医大学实验动物中心；抗KCNE2抗体(Ab1)购于美国Alomone公司；蛋白质测定试剂盒购于BioRad公司；ECL检测试剂盒购于Invitrogen公司。

　　1.2 膜蛋白的制备 分取3只幼龄(4周)和3只高龄(23周)SHR的心脏，快速置干冰上，分取左右心室、心房和室隔膜组织，采用文献[9]报道的方法制备膜蛋白。具体方法如下：所取组织分别在TE(pH 7.4)溶液(1∶10)中匀浆，1000g离心10min，收集上清；40000g超速离心10min，沉淀物重溶于含0.6mol/L KI的TE中，置冰上10min；40000g超速离心10min，沉淀物重溶于含2%(体积分数)Triton X100的TE中，置冰上1h；13000g离心10min以除去沉淀物。所得的上清液为膜蛋白液。并用BioRad蛋白质测定试剂盒定量膜蛋白，分装后-20℃保存待测。以上步骤均在4℃下进行，所有的试剂中均含有蛋白质抑制剂(1mmol/L iodoacetamide、1mmol/L 1，10phenanthroline、2μg/mL aprotinin、1mmol/L benzamidine、1μg/mL pepstatin and 0.5 mmol/L pefebloc)。

　　1.3 Western印迹实验 以100g/L的SDS聚丙烯凝胶分离膜蛋白后，转移到polyscreen PVDF膜上，将PVDF膜浸在含0.1%(体积分数)Tween 20的PBS(简称TBS液)中1h，放入初级抗体溶液中，4℃下过夜孵育；TBS液洗2次，二级抗体液中孵育1.5h，TBS洗3次。用ECL检测试剂盒检测KCNE2蛋白条带的免疫强度，并用Chemi Imager成像系统采集实验结果所得的图像，用相关的软件(aInnotech)对图像中的免疫强度进行分析。

　　1.4 统计学处理 实验数据以均数±标准差表示，所有数据处理在Prism 4.0统计学软件上进行。多组间的显著性差异采用单因素方差分析，两组间的差异分析用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 KCNE2蛋白在SHR心肌不同组织中的分布 以幼龄和高龄SHR心肌不同部位的膜蛋白为样品，以抗KCNE2的多克隆抗体(Ab1)为一抗，进行Western 印迹实验。结果显示，在幼龄和高龄SHR左、右心室、室隔膜和心房组织中均有KCNE2蛋白的分布(图1)。

　　图1 以抗KCNE2的抗体(Ab1)为一抗的Western印迹图（略）

　　Fig.1 Western blot probed with antiKCNE2(Ab1)

　　20ku band corresponding to KCNE2 protein in samples; Lanes 1， 2 and 3: identical membrane proteins quantities (40μg ) from each of 3 different old rats; Lanes 4， 5 and 6: identical membrane proteins quantities (40μg ) from each of 3 different young rats; Lane 7: reference KCNE2 protein for data normalization. RV: membrane proteins from right ventricular myocardium; Sept: membrane proteins from interventricular septum; LV: membrane proteins from left ventricular myocardium; Atria: membrane protein from atrial myocardium

　　2.2 幼龄SHR心脏不同部位KCNE2表达水平的比较 在幼龄SHR右心室、室隔膜、左心室和心房膜蛋白样品之间，KCNE2的表达水平没有显著的差异(P>0.05，图2)。

　　2.3 高龄SHR心脏不同部位KCNE2表达水平的比较 在高龄SHR右心室、室隔膜、左心室和心房膜蛋白样品之间，KCNE2的表达水平没有显著的差异(P>0.05，图2)。

　　图2 KCNE2在幼龄和高龄SHR心脏不同部位组织膜蛋白中的表达水平（略）

　　Fig.2 Expressional levels of KCNE2 proteins between different parts of heart tissues from young rats and old rats

　　RV: membrane proteins from right ventricular myocardium; Sept: membrane proteins from interventricular septum; LV: membrane proteins from left ventricular myocardium; Atria: membrane protein from atrial myocardium. *P<0.05 vs. young rats

　　2.4 KCNE2在幼龄和高龄SHR心脏不同部位表达水平的比较 KCNE2在高龄SHR大鼠的右心室(RV)和室隔膜(Sept)组织中的表达水平显著高于其在幼龄大鼠相同组织中的表达(P<0.05和P<0.001)；而KCNE2在高龄SHR大鼠左心室(LV)和心房(Atria)组织中的表达水平与该幼龄大鼠心脏中相应组织中的表达无显著性差异(P>0.05)。

　　3 讨论
　　
　　在KCNE蛋白家族中，从功能、分布和表达水平上来讲，KCNE2蛋白是目前研究中最有争论的一个亚基蛋白[4]。有资料认为，KCNE2的分布和表达与心源性长QT间期综合征(LQTs)有一定的关联性[10]。SHR由Okamoto和Aoki选育成功，该鼠在4周龄时，血压正常，5周龄时血压可达150mmHg，成年后血压平均为170-180mmHg，最高可达200mmHg以上。因此，SHR也称为自发性高血压大鼠。另外，该鼠除有高血压自发率为100%特点外，还有高血压性心血管病变。本研究采用了KCNE2特异性抗体，利用Western印迹法对幼龄和高龄SHR心脏不同部位KCNE2表达和分布的情况进行了分析。
　　
　　Yu等[3]报道在心肌组织中，KCNE2 mRNA的表达水平非常低[3]。在本研究中，当以Ab1为初级抗体进行Western印迹实验时，不论是幼龄还是高龄SHR，其心脏的左右心室、室隔膜和心房组织中，KCNE2蛋白表达量均达到可检测的水平，说明在SHR心脏不同部位都有KCNE2的分布。但KCNE2在同龄(幼龄或高龄)SHR心脏各组织之间(心房、心室和室隔膜)的表达水平均没有显著的差异。另外，在高龄大鼠心脏右心室和室隔膜中，KCNE2蛋白的表达显著地高于其在幼龄大鼠心脏同一组织中的表达，但由于样本量太少，此结果尚需扩大样本量证实。在心脏不同的部位，分布着许多不同类型的钾通道[11]，而不同部位的钾通道可以产生各种特殊的电生理特征[12]。KCNE2可以与多个钾通道的a亚基结合，形成分布在心脏不同部位的不同的钾电流[89，13]。KCNE2蛋白可以改变多个钾通道α亚基的电生理功能[3]，而离子通道蛋白各亚基的表达水平会直接影响到心脏的电生理活动[11]，并且与LQTs疾病的发生有着密切的关系[10，14]。
　　
　　本研究结果显示，KCNE2蛋白在高龄SHR心室和室隔膜组织中的表达上调，而在心房组织中出现下调，提示在幼龄和高龄SHR的心脏组织之间，KCNE2蛋白表现出不同的表达调节方式。这一方面可能在高血压的发生、发展过程中起着作用；另一方面通过影响心室和心房组织中不同的钾通道的生理功能，进而引发高龄SHR心血管疾病的发生。当然，KCNE2在高龄和幼龄大鼠心脏不同部位的这种表达的差异，是否会通过影响心脏的电生理而在SHR大鼠心脏病变过程中起着一定的作用，尚有待于从电生理水平上进一步研究。

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