雷帕霉素联合顺铂对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用

　　　　　　作者：段钊，杨雪梅，邢兰瑛，潘艳艳，王艳华，李虹

【摘要】 目的 探讨雷帕霉素单独及联合顺铂应用对人卵巢癌SKOV3细胞生长的影响及可能的分子机制。方法 体外培养人卵巢癌SKOV3细胞，实验组分别采用不同浓度的雷帕霉素、顺铂及40nmol/L雷帕霉素+10μmol/L顺铂作用，MTT法检测上述药物对细胞的增殖抑制率;流式细胞仪检测分析细胞凋亡率及细胞周期分布变化。结果 雷帕霉素单独及联合顺铂应用均可显著抑制人卵巢癌SKOV3细胞的增殖，其作用呈现时间剂量依赖性，且两药联合作用时抑制率显著增高(P<0.05)，显示两药有协同作用;流式细胞仪检测显示雷帕霉素能使卵巢癌SKOV3发生G1期阻滞，同时可诱导细胞凋亡，其凋亡率随用药浓度增加而增加。结论 雷帕霉素和顺铂可显著地抑制人卵巢癌SKOV3细胞的增殖，阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡，且两药联合应用时呈现协同作用。

【关键词】 雷帕霉素;顺铂;卵巢癌SKOV3细胞;细胞周期;细胞凋亡

　ABSTRACT: Objective To study rapamycin alone or in combination with cisplatin on the growth of human ovarian cancer SKOV3 cells and the possible molecular mechanism. Methods Human ovarian cancer SKOV3 cells were cultured in vitro. The experimental group was administered with different concentrations of rapamycin and cisplatin， and 40nmol/L rapamycin+10μmol/L cisplatin. MTT assay was applied to examine these drugs inhibition rate on cell proliferation; flow cytometry was used to analyze the apoptosis rate and cell cycle distribution. Results Rapamycin alone or in combination with cisplatin could significantly inhibit the proliferation of human ovarian cancer SKOV3 cells in time and dosedependent manners， and the joint effect of the two drugs had a significantly higher inhibition rate (P<0.05)， showing their synergistic effects. Flow cytometry revealed that rapamycin could cause G1 phase arrest of ovarian cancer SKOV3 cells and induce apoptosis at the same time; the apoptosis rate increased with the increase in drug concentration. Conclusion Rapamycin and cisplatin can significantly inhibit the proliferation of human ovarian cancer SKOV3 cells， arrest cell cycle and induce cell apoptosis， and the two drugs administered in combination show synergistic effects.

　　KEY WORDS: rapamycin; cisplatin; ovarian cancer SKOV3 cell; cell cycle; cell apoptosis

　　哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin， mTOR)是一种组成非常保守的丝/苏氨酸激酶，是磷酸肌醇激酶3相关激酶(phosphoinositide 3 kinaserelated kinase， PIKKs)家族中的一员，它可以整合氨基酸、能量、生长因子等所激发的信号通路，借以调控细胞生长增殖和细胞周期。研究显示，在胰腺癌、肺癌、前列腺癌、食管癌等多种肿瘤中均可发现mTOR信号传导通路被过度激活[15]。抑制mTOR靶蛋白可诱导肿瘤细胞凋亡、阻滞细胞周期运行、抑制细胞生长增殖、以及逆转其对化疗药物的耐药性。因此，mTOR已成为肿瘤治疗的新靶点。雷帕霉素是一种大环内酯类抗生素，具有较强的免疫抑制、抗真菌和抗肿瘤作用，是mTOR的特异性抑制剂。我们的研究观察了不同浓度雷帕霉素、顺铂单独及联合作用对人卵巢癌SKOV3细胞生物学活性的影响，进一步探讨了雷帕霉素的抗肿瘤作用机制，以期为临床治疗卵巢癌提供新的思路。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 人卵巢癌SKOV3细胞株由西安交通大学医学院环境与疾病相关基因教育部重点实验室提供。雷帕霉素(纯度≥98%)购自上海贝基生物科技有限公司;RPMI1640培养基、二甲基亚枫(DMSO)购自美国Gibco公司;顺铂注射液、新鲜胎牛血清、四甲基偶氮唑蓝(4 methyl thiazolyl tetrazolium， MTT)、胰蛋白酶、碘化丙啶(propidium iodide， PI)染液等购自美国Sigma公司。

　　1.2 细胞培养 人卵巢癌SKOV3细胞生长于含10mL/L小牛血清的RPMI1640+双抗的培养液中，置于37.0℃、5mL/L CO2、100%湿度的恒温培养箱中进行传代培养。细胞呈贴壁生长。

　　1.3 细胞处理与分组 以DMSO溶解雷帕霉素纯品至0.1mol，微孔滤膜过滤除菌，分装4℃保存，临使用时用RPMI1640培养基稀释成实验用各种浓度。顺铂溶于生理盐水中配制成浓度10μmol/L，除菌，4℃储存。实验设对照组(仅含正常生长的SKOV3细胞)、实验组6组(分别经雷帕霉素终浓度为20、40、80、160nmol/L、顺铂10μmol/L、40nmol/L雷帕霉素+10μmol/L顺铂干预的SKOV3细胞组)，每组设3个复孔。另外，设仅加培养液的空白孔以调零。

　　1.4 MTT法检测细胞增殖抑制率 卵巢癌SKOV3细胞以5×104/mL浓度接种于96孔培养板中，常规培养24h，换实验用培养基干预。在药物干预24、48、72h后收集，弃原培养液，每孔加入MTT溶液(5g/L)20μL继续培养4h，离心弃上清液，每孔内加入二甲基亚枫(dimethyl sulfoxide， DMSO)150μL，振荡10min，至紫色结晶物充分融解后，选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔的吸光度值(A)。按照下列公式计算人卵巢癌SKOV3细胞的生长抑制率(inhibition ratio， IR)：IR=(1-实验组平均A值/对照组平均A值)×100%。实验重复3次。

　　1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡和分析细胞周期 收集经不同浓度雷帕霉素溶液(终浓度分别为20、40、80nmol/L)、顺铂10μmol/L及40nmol/L雷帕霉素+10μmol/L顺铂进行处理后24h的细胞，用冰预冷的700mL/L乙醇2mL固定，4℃储存，过夜。PBS(pH 7.4)液洗涤、重悬细胞，加入200μL PI混合液(含100mg/L的PI，500mg/L的Rnase酶)室温下避光孵育30min，PBS(pH 7.4)液洗涤后于1h内上流式细胞仪检测，并用Modifit1.0软件分析结果。

　　1.6 统计学处理 所得数据均采用SPSS16.0统计软件进行数据分析，数据符合正态分布并经方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析法，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 不同浓度雷帕霉素在不同时间内对卵巢癌SKOV3细胞增殖抑制作用的影响 通过MTT比色法我们观察了不同浓度雷帕霉素作用于卵巢癌SKOV3细胞系24、48、72h后的细胞抑制率，结果显示各实验组均呈现明显的细胞增殖抑制作用，各组间比较差异有显著性(P<0.05)。提示雷帕霉素对卵巢癌SKOV3细胞具有显著的增殖抑制作用，且在一定范围内这种作用呈剂量时间依赖性(图1)。

　　2.2 40nmol/L雷帕霉素、10μmol/L顺铂单独及联合作用对SKOV3细胞的影响 MTT比色法检测显示，雷帕霉素、顺铂单独用药组的细胞增殖抑制率随用药时间的延长而增高，各组间比较差异均有显著性(P<0.05);且联合用药组较单独用药各组的细胞增殖抑制率明显增高，各组间比较差异也均有显著性(P<0.05)。提示雷帕霉素与顺铂联合应用有明显协同作用，可增加肿瘤对顺铂的敏感性(图2)。

　　2.3 药物对卵巢癌SKOV3细胞凋亡率的影响 流式细胞仪检测显示雷帕霉素单独应用时，随着用药浓度的增加，其细胞凋亡率呈现明显增强的趋势，由3.82%逐渐增高至24.43%，诱导凋亡效应呈现剂量效应依赖性。当雷帕霉素与顺铂联合应用时，其细胞凋亡率为42.75%，较单独应用雷帕霉素(凋亡率3.82%～24.43%)及顺铂(11.50%)时均明显增高，显著高于两药单独处理组(图3)。

　　2.4 药物对卵巢癌SKOV3细胞周期分布的影响 从细胞周期分布图来看，对照组DNA方图为典型肿瘤细胞G1、S、G2峰型。经不同浓度雷帕霉素、10μmol/L顺铂、40nmol/L雷帕霉素+10μmol/L顺铂作用人卵巢癌SKOV3细胞24h后，与对照组相比，随着用药浓度的增加，S期细胞比例逐渐降低，G1期细胞比例逐渐增高，雷帕霉素使卵巢癌SKOV3发生G1期阻滞(表1)。

　　3 讨 论

　　目前，卵巢癌正不断的向临床医生发出严峻的挑战。它严重威胁着妇女的健康和生命。在临床上，我们发现耐药和复发已成为治疗失败的重要原因。因表1 不同浓度雷帕霉素、顺铂及二者联合作用24h对SKOV3细胞周期的影响此，研究新的卵巢癌治疗方案，已迫在眉睫。mTOR是一种丝/苏氨酸激酶，是新近发现的PIKKs家族中的一员。它可整合生长因子、氨基酸、能量等所激发的信号通路，借以调控细胞生长增殖和细胞周期。它在由PI3K/Akt传导通路介导的增殖信号的传导中起重要作用，可通过改变翻译调节因子4EBP1和S6K1的磷酸化状态启动翻译过程[67]。多项实验已证明，抑制潜在的mTOR靶蛋白信号转导通路可诱导强烈的抗增殖和抗血管生成作用[710]。现已发现，与肿瘤发生密切相关的多种生理过程如细胞生长增殖、细胞周期调控、细胞迁移等都受到mTOR的调控;cyclin D、cmyc等多种癌基因的表达在翻译水平上也受到mTOR调控。因此，以抑制mTOR为主要作用原理的雷帕霉素成为新的抗肿瘤药物，已进入临床开发的早期阶段。研究表明，雷帕霉素抗肿瘤作用的基本原理是通过与FKBP( FK506结合蛋白)结合，抑制mTOR活性，阻止S6K1和4EBP1磷酸化，同时也间接抑制了其他相关蛋白的转录和翻译，最终导致细胞周期停滞和细胞凋亡[11]。同时，雷帕霉素还可抑制肿瘤血管的生成。更为重要的是，雷帕霉素对肿瘤细胞具有选择性杀伤作用，其对正常细胞毒副作用较小[12]。

　　本实验中，我们应用不同浓度雷帕霉素作用于卵巢癌SKOV3细胞，结果显示细胞增殖受到明显抑制，且随着用药时间及浓度的增加，其抑制率也呈现增强的趋势，各组间比较差异有显著性(P<0.05)。说明雷帕霉素在体外对卵巢癌SKOV3细胞株具有杀伤作用，其抗增殖效应呈现剂量时间依赖性。

　　卵巢癌对化疗较为敏感，即使已有广泛的转移也能取得一定疗效。因此，化疗仍是目前治疗卵巢癌最主要的辅助方法。顺铂是卵巢癌治疗中最常用的化疗药物。本研究通过MTT比色法分别观察了40nmol/L雷帕霉素、10μmol/L顺铂及40nmol/L雷帕霉素+10μmol/L顺铂作用于卵巢癌SKOV3细胞24、48、72h后的细胞增殖抑制率，发现雷帕霉素与顺铂联合应用，极大地提升了SKOV3细胞对顺铂的敏感性，两药联合应用较其单独应用时的抑制率明显增高，各组间比较差异有显著性(P<0.05)。表明雷帕霉素与顺铂联合应用治疗卵巢癌时，既能通过提升顺铂的抗肿瘤效果来克服肿瘤对化疗药物的耐受性，又可通过减低顺铂的使用剂量而克服化疗药的毒副作用。因此，它是一种非常值得推广的化疗方案。

　　诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期是一些化疗药物抑制肿瘤细胞增殖的重要机制。HIDALGO等[9，1315]研究发现雷帕霉素可阻断PI3K/Akt/ mTOR信号传导通路，抑制S6K1和4EBP1磷酸化，从而使细胞15%～20%的蛋白翻译受到抑制并干扰细胞周期中蛋白产物的表达和细胞周期依赖性激酶(CDK)的活性，使细胞周期在G1后期S期被阻断，导致细胞周期阻滞，同时诱导细胞凋亡。我们的研究结果显示，雷帕霉素和顺铂单独及联合作用于卵巢癌SKOV3细胞株均可起到诱导凋亡作用，其中雷帕霉素诱导凋亡效应呈现剂量效应依赖性;两药联合应用时凋亡率显著升高，与MTT检测结果相符。同时，我们还发现雷帕霉素可使人卵巢癌SKOV3细胞发生G1期阻滞，抑制肿瘤细胞增殖，并且存在剂量效应依赖关系。这与HIDALGO等的研究结果相似。雷帕霉素的促凋亡机制是否因为细胞长期处于G1期而触发了凋亡还有待进一步证实。

　　本研究初步探讨了mTOR信号传导通路在卵巢癌发生发展中的重要作用及其抑制剂雷帕霉素的抗肿瘤机制，为寻找新型抗肿瘤药物及临床卵巢癌化疗新方案提供了理论和实践基础。由于mTOR信号通路机制及其抑制剂雷帕霉素抗肿瘤作用的内在机制复杂，是否雷帕霉素还可通过其他机制发挥其抗肿瘤作用等诸多问题还有待进一步的研究。

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