一种简单易行的细胞凋亡检测方法

【摘要】 目的 以青蒿素诱导人胶质瘤U251细胞凋亡为例，介绍一种简单易行的细胞凋亡检测方法。方法 将用青蒿素处理过的、悬浮培养的人胶质瘤U251细胞，用液氮冻融，然后加入3mmol/L的PI 30μL，室温下放置5min后，用流式细胞仪测定细胞的倍体特性，计算细胞凋亡率。结果 在1×10-4、1×10-5和1×10-6mol/L剂量下，青蒿素诱导人胶质瘤U251细胞的凋亡率分别为33.2%、24.0%和8.0%。结论 本实验结果显示，青蒿素有明显的诱导人胶质瘤U251细胞凋亡的作用，并显示有明显的剂量依赖关系。本方法简化了细胞处理过程，避免了许多影响因素，不失为一种简单、准确、快速的细胞凋亡检测方法。

【关键词】 青蒿素;细胞凋亡;流式细胞仪;凋亡检测

　　ABSTRACT: Objective To introduce a simple and easy method for cell apoptosis analysis as an example with artemisinin to induce apoptosis of human U251 cells. Methods Human U251 cells， cultured in suspension and treated with artemisinin， were freezethawed. 30μL of 3mmol/L PI was then added and mixed. After being placed under room temperature for 5min， the cellular ploidy was analyzed by flow cytometry， and the ratio of cell apoptosis was calculated. Results The ratio of human U251 cell apoptosis induced by artemisinin at a dose of 1×10-4， 1×10-5 and 1×10-6mol/L was 33.2%， 24.0% and 8.0%， respectively. Conclusion The results showed that artemisinin significantly induced the apoptosis of human U251 cells in a dosedependent manner. Using this method to analyze cell apoptosis can reduce the procedure of cell treatment and avoid many influential factors. Therefore， it can be regarded as a simple， accurate and rapid method for detecting cell apoptosis.

　　KEY WORDS: artemisinin; cell apoptosis; flow cytometry; apoptosis detection

　　细胞凋亡是保持细胞增殖和死亡之间的平衡、维持自身内环境稳定的一种形式。对于细胞凋亡检测，人们已经建立了诸如透射电镜超微结构法、DNA阶梯电泳、线粒体膜电位、DNA末端标记(BrdU)、Annexin VPI双标记法、Caspase活性检测等方法[12]，并且得到了广泛的应用。但这些方法都较复杂，影响其结果准确性的因素较多，且价格昂贵。我们以青蒿素诱导人胶质瘤U251细胞凋亡为例，介绍一种简单易行、快速可靠、价格低廉的细胞凋亡检测方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 人胶质瘤U251细胞株， 购自中科院上海细胞生物所。青蒿素，成都欧康植化科技有限公司产品，纯度≥95%，用二甲基亚砜(DMSO)配制成10-3mol/L母液，4℃保存。实验前用不含胎牛血清的RPMI 1640培养基稀释成所需浓度，培养基中的二甲基亚砜终浓度为1.0g/L。碘化丙啶(PI)，Sigma公司产品，用双蒸水配制成3mmol/L的溶液，4℃避光保存。RPMI 1640为Gibco公司产品。CO2细胞培养箱，美国FORMA公司产品。FACSCalibur型流式细胞仪，美国BD公司产品。

　　1.2 方法 细胞培养：将U251细胞培养于未包被的24孔板中，培养基为含100mL/L小牛血清、青霉素和链霉素各1×10u/L的RPMI 1640。在饱和湿度、37℃、50mL/L CO2条件下悬浮培养，每3d传代一次，取对数生长期的细胞进行实验，细胞的起始接种浓度为5×107个/L。青蒿素先用生理盐水稀释过滤除菌后，4℃保存。使用时用适量不含胎牛血清的RPMI 1640培养基稀释成所需浓度。

　　细胞凋亡测定：取指数生长期的细胞，按上述条件培养24h后，用适当浓度的青蒿素诱导细胞死亡或者凋亡。从培养板中取悬浮培养的细胞0.3mL(细胞浓度约为1×106个/mL)，放在流式细胞仪测定试管中，用液氮冻结，室温下溶解，然后加入3mmol/L的PI 30μL，5min后，用流式细胞仪检测。检测前，设置点图的横坐标为PI，纵坐标为SSC(Side scatter：侧向散射光)，以PI阳性的细胞群设门(包括坏死和凋亡的细胞)，点图设置为线性模式;直方图的横坐标为PI，在第三荧光通道(FL3，610nm)在对数(log)模式下测定二倍体和四倍体细胞的倍性。细胞染色时应保留一管细胞不染色，作为空白对照，用于调节测试条件(即FL3的测试电压)。

　　1.3 统计分析 实验结果表示为±s，用Student t检验进行组间比较。P<0.05为有统计学意义。

　　2 结 果

　　青蒿素有明显的诱导人胶质瘤U251细胞凋亡的作用，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，并且显示有明显的剂量依赖关系(表1)。表1 青蒿素诱导人胶质瘤U251细胞凋亡的作用

　　图1A为正常对照组，显示的是活的、未同步化细胞的DNA直方图。其中有两个高耸的峰，左边的峰为二倍体细胞(2n，G0、G1期细胞)，右边较低的峰为四倍体细胞(4n，G2、M期细胞)，中间的平台为非配对体细胞(S期细胞)。图1B最高峰的左边是低倍体细胞，即凋亡或坏死(图1C)的细胞。流式细胞仪检测结果显示，青蒿素组的细胞凋亡率明显增加(图1)，结果与表1一致。说明青蒿素有诱导人胶质瘤U251细胞凋亡的作用。

　　处于静止期和未分化的活细胞的流式细胞仪DNA分布图显示二倍体DNA峰(2n， 包括处于G0、G1期的细胞)，而分裂前期和正在分化的细胞显示出4倍体DNA峰(4n，包括G2 、M期细胞)。A：未同步化的活细胞显示有典型的2n、4n二相峰;B：由于凋亡期间，DNA部分丢失和碎片形成，凋亡的细胞显示为低倍体DNA形式(即亚二倍体峰);C：坏死的细胞因为其细胞核内的DNA保持完整，显示的也是二相峰，但没有低倍体DNA。

　　3 讨 论

　　青蒿素是从菊科植物青蒿提取出来的化合物，主要用于治疗疟疾，现已在全世界得到广泛应用[34]。近些年的研究证明 ，青蒿素除了其清热、抗炎及免疫调节等作用外，还对多种实体瘤细胞有明显的生长抑制作用。本实验的研究结果表明，青蒿素有诱导人胶质瘤U251细胞凋亡的作用。

　　PI是一种核酸标记物，能与DNA双螺旋结构中的宽槽区域结合，并且经激光激发，能发射出特异性荧光(570～610nm)。根据其荧光强度，确定DNA的含量，又根据DNA的含量测定细胞的倍体特性。凋亡程序启动以后，细胞核酸内切酶活化，DNA降解，细胞内的DNA含量减少，出现低倍体细胞。这是本方法的基本原理。同样，坏死细胞的DNA含量也明显降低，细胞的体积也明显减少，在流式细胞仪的点图上明显分群。因此，本方法也可以用于区分和测定坏死的细胞。由于细胞凋亡的后期，也会发生继发性细胞坏死，因此，测定的结果反映的是总的细胞凋亡率。如果需要测定细胞坏死率时，可以在点图上设门时选定死亡细胞群，用直方图显示和计算出细胞坏死率。

　　本方法使用的是悬浮培养细胞，而没有使用贴壁培养的细胞，以避免胰酶消化、EDTA、反复冲洗等处理过程对细胞的影响;也不需要使用RNase A;直接使用培养基，而不需要使用PBS等其他溶液。由于减少了细胞处理的过程，从而减少了许多影响因素，使实验过程更加简单、快速，结果更加准确。实际应用中也可以根据自己的实验需要和实验条件，使用贴壁培养的细胞，但后期的细胞处理，即破膜和细胞染色的过程是一样的。一般情况下，细胞膜本身固有的屏障功能，PI很难进入细胞内与DNA结合。本方法用液氮将细胞冻融，破坏细胞膜，增加其通透性，使PI能很快进入细胞内，并与DNA结合。本方法实验过程简单、快速、可操作性强、成本低廉，可以根据研究的需求选用本方法。

参考文献

　[1]VERMES I， HAANEN C， REUTELINGAPERGER C. Flow cytometry of apoptotic cell death [J]. J Immunol Methods， 2000， 243(2):167190.

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　　[3]姚谦明，程国雄，汤冬漩，等. 青蒿素对体外培养人U251细胞凋亡和增殖的作用 [J]. 实用医学杂志， 2008， 24(24):41774179.

　　[4]谢红，姚丽，陈立军，等. 青蒿素诱导人白血病细胞K562凋亡的线粒体机制 [J]. 现代生物医学进展， 2009， 9(1):2729