多发性骨髓瘤MMSA1抗原的二级结构预测及多克隆抗体的制备

　　　　作者：周芙玲，张王刚，王佰言，张鹏宇，古流芳，张文娟，蒙昕，田纬

【摘要】 目的 运用生物信息学技术研究人多发性骨髓瘤MMSA1(GenBank:AY952881)基因表达蛋白的二级结构和B细胞抗原表位，并制备多克隆抗体。方法 应用DNAStar Protean软件提供的模块分析和预测MMSA1蛋白的二级结构和B细胞抗原表位。采用多通道同步固相全自动合成系统合成15肽，免疫健康新西兰成年家兔，制备相应的多克隆抗体。结果 MMSA1蛋白含有较多的β折叠和转角结构。综合柔韧性、亲水性、抗原性、表面可能性、二级结构、偶联难易及实验难度等因素，选取了MMSA1蛋白序列318～333位作为抗原表位，即SSSLLPQSPAPTEHL，15肽合成产物经HPLC纯化和质谱检测，纯度达到98.65%，序列正确。免疫兔子获得血清抗体采用层析柱纯化，ELISA检测效价：1∶6000。结论 本研究为基于人MMSA1抗原表位手段的免疫治疗研究提供了理论依据。

【关键词】 多发性骨髓瘤;MMSA1;二级结构;抗原表位;多克隆抗体

ABSTRACT: Objective Prediction was made for a novel antigen (multiple myeloma special antigen) MMSA1 in human multiple myeloma by using bioinformatics. We predicted the secondary structure and B cell epitopes， and elicited specific antibody using peptidemicrospheres and adjuvants. Methods The secondary structure and B cell epitopes of MMSA1 protein were determined by graphic analysis using the Protean module (DNAstar Inc.). Antigenic peptides were synthesized as the antigen with Fmoc/PyBOP method. Adult New Zealand rabbits were immunized by injecting the chemical coupling of synthetic peptidesKLH to obtain antibody. Results MMSA1 protein contained more β sheet and turn regions. Antigenic peptides (SSSLLPQSPAPTEHL) were purified above 98.65% by high performance liquid chromatography and validated by mass spectrometric detection. The immunized sera analyzed with ELISA were 1∶6000 after purification using a peptide affinity column. Conclusion The prediction of tumor antigens provides thereotical evidence for the immunotherapy of multiple myeloma. Moreover， antibody preparation is useful for further study.

　　KEY WORDS: multiple myeloma; MMSA1; secondary structure; epitope; polyclonal antibody

多发性骨髓瘤是一种克隆增殖型浆细胞疾病，虽然常规的化疗、反应停、高剂量化疗后给予造血干细胞移植等方案使患者的缓解率和无病生存期明显提高，但最终难免复发，平均生存期仍仅有3～4年。近年来，肿瘤分子免疫学的快速发展为其治疗开辟了新途径，尤其是特异性抗原在肿瘤的免疫治疗中显示出重要作用[1]。鉴于此，本文拟深入研究前期实验中采用SEREX技术筛选获得的多发性骨髓瘤新抗原MMSA1(multiple myeloma special antigen， MMSA1， GenBank:AY952881)[2]，为深入开展其表位生物学研究、探索其抗原表位的位置、寻找其特征性结构位点，我们运用生物信息学技术对其结构蛋白的二级结构和B细胞抗原表位进行分析和预测，制备多克隆抗体，从而为基于人MMSA1抗原表位手段的免疫治疗研究提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 人MMSA1蛋白二级结构的预测 人MMSA1蛋白氨基酸序列(由基因序列推导)共有364个氨基酸残基，分子质量40.9ku，理论等电点8.12。应用DNAStar Protean软件提供的模块，采用GarnierRobson方法通过计算特定氨基酸残基在特定结构内部的可能性来预测蛋白质的二级结构，采用ChouFasman方法通过序列氨基酸残基的晶体结构来预测二级结构，采用KarplusSchulz方法预测蛋白骨架区的柔韧性。

　　1.2 人MMSA1蛋白B细胞抗原表位的预测 应用DNAStar Protean软件提供的模块进行。采用KyteDoolittle方法对MMSA1蛋白的疏水性进行分析，用Emini方法预测MMSA1蛋白的表面可能性，以JamesonWolf方法预测MMSA1蛋白的抗原指数。然后综合评价MMSA1蛋白B细胞抗原表位的位置。

　　1.3 人MMSA1抗原多克隆抗体的制备 采用多通道同步固相全自动合成系统合成多肽，由上海吉尔生化有限公司完成，肽链合成用Fmoc/PyBOP方法，并对所合成并纯化的多肽进行HPLC分析及质谱检测。按PIERCE公司程序将纯化后的预测MMSA1抗原多肽通过C末端Cys的SH与KLH偶联，免疫健康新西兰成年家兔，制备相应的兔抗血清，然后采用ELISA法检测抗体效价。

　　2 结 果

　　2.1 人MMSA1蛋白的二级结构预测 用GarnierRobson方法预测MMSA1蛋白二级结构(图1)，发现其形成少量α螺旋，位置分别在第1～13、27～35、52～62、70～83、99～111、202～217、225～227和356～364区段。预测结果显示MMSA1蛋白二级结构中有多个β折叠，分布比较均匀，位置分别在第37～46、93～97、126～130、144～147、182～189、193～202、227～233、246～250、283～286和294～299区段。长短不一的转角主要在第13～49、86～181、256～353，无规则卷曲结构位置主要在第239～256和310～356。采用ChouFasman方法预测MMSA1蛋白二级结构(图1)，预测的α螺旋结构较少，位置分别在第29～33、50～64、69～87、95～109、161～165、301～305、和355～364区段。用该方法发现它有β折叠结构形成，位置分别在第0～13、38～46、67～85、132～149、182～218、225～254和283～289，具有的大量转角结构位置与前法类似。综合2种方法预测：MMSA1蛋白含有较多的β折叠和转角结构。该蛋白第0～112区段可能是α螺旋中心;蛋白分子第38～98、127～147、183～254和282～306区段可能是β折叠中心。长短不一的转角主要在第13～49、86～181、256～353，无规则卷曲结构位置主要在第239～256和310～356。采用KarplusSchulz方法提示MMSA1蛋白骨架区含有较多的柔韧性区域(图1)，最长在305～360区段，整体发生扭曲、折叠的几率较高，能形成丰富的二级结构。柔韧性区域分布比较均匀，提示该蛋白肽段的柔韧性较大，形成抗原表位的可能性较大，容易与抗体进行嵌合。

　　2.2 MMSA1蛋白B细胞抗原表位的预测分析 采用KyteDoolittle方法对蛋白的亲水性进行了分析(图1)。结果显示该蛋白存在众多的亲水性区域，亲水性区域的分布不均匀，其中以结构蛋白的中间区段和近羧基端的亲水性较高，所跨区段也较大(第8～39、88～184、254～282和295～364区段)。表面可能性较高区域被认为位于蛋白分子表面。表面可能性较低区域，则埋藏于蛋白分子内部区域。用Emini方法预测MMSA1蛋白的氨基酸呈现在表面可能性较大的区域(图1)，主要是第8～21、118～129、149～154、177～184、256～275、306～320和325～364区段，其他部位展示的表面可能性较小或表现为负值。通过JamesonWolf方法分析MMSA1基因潜在的蛋白抗原决定簇(图1)，结果显示此蛋白含有许多抗原指数较高的区域(第5～38、88～131、146～183、218～227、255～286、291～364区段)，其中以近中间区段和近羧基端的指数性最高，所跨区域也较大，提示这些区段含有潜在优势抗原表位。

　　2.3 人MMSA1抗原多肽的合成及纯化 综合柔韧性、亲水性、抗原性、表面可能性、二级结构、偶联难易及实验难度等因素，选取了MMSA1蛋白序列318～333位作为抗原表位，且与已知蛋白同源性低。采用多通道同步固相全自动合成系统合成15肽， 即SSSLLPQSPAPTEHL。多肽合成产物经HPLC纯化和质谱检测，纯度达到98.65%，序列正确。

　　2.4 多克隆抗体的制备 按PIERCE公司程序将纯化后的MMSA1预测抗原多肽通过C末端Cys的SH与KLH偶联，将偶联KLH的多肽与弗氏佐剂充分混合，免疫新西兰兔，血清抗体采用层析柱纯化，BCA蛋白定量法测抗体的蛋白浓度2.0g/L。492nm读取吸光度(A)值，以阳、阴性比值(P/N)>3为阳性的判定标准，ELISA检测效价为1∶6000。

　　3 讨 论

　　近年来，生物信息学在新基因结构功能的预测方面价值不可估量，能够为研究提供有力指导。免疫表位在多肽疫苗的研发中也受到国际血液及肿瘤学界的高度重视，例如HLAA*0201和HLAA*2402限制性WT1多肽疫苗的临床试验已经启动[3]。NISTIC等[4]报道化疗与多肽疫苗在治疗黑色素瘤方面可以起到协同作用，氮烯咪胺化疗后接种疫苗能提高长效记忆性CD8+T细胞的反应，进一步裂解HLAA2(+)/MelanA(+)肿瘤细胞。多能抗原肽(multiple antigen peptide)分子性质稳定，能抵抗蛋白酶和肽酶，也是今后肽类药物发展的方向之一[5]。因此，我们有必要对MMSA1蛋白的二级结构和其B细胞表位进行深入分析。

　　生物学家设计了许多分子生物学软件用于蛋白质的分析，其中Protean是功能强大的蛋白分析软件，目前已被广泛应用[6]，其具体功能有：分析和预测蛋白质结构，提供各种分析方法并以图形的格式输出结果，显示蛋白质分子的各种理化特性以及抗原决定族等功能区的预测功能。本次对MMSA1蛋白的二级结构和潜在的B细胞抗原表位进行了预测和分析，分析结果表明该MMSA1蛋白α螺旋中心集中，并含有较多分散的β折叠，结果还表明长短不一的转角和无规则卷曲结构位置主要在第239～356区段。蛋白质的二级结构对蛋白质的抗原表位有很大影响。α螺旋、β折叠等二级结构的化学键键能比较高，能够较牢固地维持蛋白的高级结构，不适宜作为抗原表位。而蛋白质的转角及无规则卷曲等二级结构则是比较松散的结构，易于发生扭曲、盘旋，并展示在蛋白的表面，因此该区域常含有B细胞的优势抗原表位。本研究的分析结果表明在MMSA1蛋白的近羧基端含有较多的转角结构，同时该区域的抗原指数较高，其亲水性指数和呈现在蛋白表面的可能性也比较大。因此，该区段的抗原表位应该是优势抗原表位所在。其他一些区段也可能含有一些潜在的抗原表位，如第5～38、88～131、146～183、218～227区段等。这些区域的抗原指数也较高，但是146～183及218～227柔韧性指数偏低，88～131表面可能性指数负值且亲水性指数偏低，需要综合性看待其作为抗原表位的可能性。

　　制备一种效价高、特异性好的抗体，是研究疾病相关基因的表达、定位等生物学功能及有效治疗中非常重要的一步。经典的抗体制备方法是构建重组原核表达载体，在E.coli中表达纯化融合蛋白并免疫动物。但是，通过经典的构建重组原核表达载体的方法有时不能得到融合蛋白，这将限制我们对较多抗原的研究。合成多肽技术是根据软件分析基因序列，预测其抗原决定簇，选取抗原性强的编码序列合成抗原肽，飞行质谱验证合成的目的肽段，高效液相色谱检测纯度。近年来用于疫苗或抗毒素制备等，偶有用于研究较难得到融合蛋白新基因的报道[78]。合成多肽技术化学合成产物不存在细胞和细菌蛋白，且分子质量小，结构简单，从而避免了与其他病毒或细菌抗体的交叉反应的可能。另外，较容易暴露抗原表位，从而加强了抗原性。细胞识别蛋白抗原时是以其表面的抗原受体与蛋白抗原表位结合。实验证实，基于软件预测的抗原表位而合成的多肽被用来免疫动物后可取得较好的免疫治疗效果[910]。本实验预测MMSA1蛋白可能的二级结构、柔韧性和抗原性高低等，根据分析结果选取预测抗原性较高，与已知蛋白同源性低的多肽片段，采用固相合成法合成，将偶联KLH的多肽与弗氏佐剂充分混合为免疫原，程序化免疫兔子获得MMSA1多克隆抗体，ELISA检测效价的高低。我们将进一步应用Westernblot印迹验证抗体具有的特异性。

　　总之，综合运用生物信息学的技术方法对有关信息进行分析、处理、模拟和预测，制订出切实可行的方案，可以增强实验的目的性，提高实验的成功率。我们应用新型疫苗主动免疫治疗化疗无效或化疗不能耐受的多发性骨髓瘤已取得肯定疗效[11]，MMSA1编码蛋白分析及多克隆抗体的制备有利于肿瘤抗原的进一步鉴定，将为研制开发高效、低毒、价廉的肿瘤生物制剂提供重要的科学依据。

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