作者：宋杨，于涛，庞磊，刘影，韩璐，杨菁
【摘要】 目的 建立测定大鼠脑组织中游离天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽以及γ-氨基丁酸含量的高效液相色谱法。方法 采用C18色谱柱，以乙腈和25 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.8)为流动相，用邻苯二甲醛为柱前衍生剂，流速为1 mL/min，激发波长为338 nm，发射波长为425 nm，在柱温38℃下采用二元梯度洗脱，同时对大鼠脑组织中游离天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽以及γ-氨基丁酸的含量进行了测定。结果 天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽以及γ-氨基丁酸在该色谱条件下均可基线分离，在0.5～6 μg/mL范围内呈现良好线性关系，天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽以及γ-氨基丁酸的相关系数分别是0.9991，0.9998，0.9996，0.9995。回收率分别为99.80%，99.74%，99.63%，99.34%。结论 该方法灵敏可靠，专属性强，重现性好。天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽以及γ-氨基丁酸在大鼠脑组织中的含量分别为0.77±0.04、1.16±0.07、0.36±0.05、1.30±0.06 mg/g。
【关键词】 天门冬氨酸;谷氨酸;γ-氨基丁酸;肌肽;邻苯二甲醛
Abstract： Objective To establish HPLC methods to determine free Aspartate， Glutamate， Carnosine and GABA in brain.Methods The sample was derived from O-phthalaldehyde (OPA)， and then the derivative sample was separated on Kromail C18 column at 38℃. A linear gradient elution of A (0.025 mol/L phosphate buffer of 3% Acetonitrile， pH 6.8) and B (0.025 mol/L phosphate buffer of 50%Acetonitrile) was used， the flow rate was 1 mL/min， and detected by fluorescence detector with excitation wavelength (λex) at 338 nm and emission wavelength (λem) at 425 nm.Results Aspartate， Glutamate， Carnosine and GABA were separated to baseline. A good linearity was obtained over the range of 0.5 to 6 μg/mL， and the correlation coefficients of Aspartate， Glutamate， Carnosine and GABA were 0.9991， 0.9998， 0.9996 and 0.9995， respectively，the recoveries were 99.34%～99.80%. Conclusions The result shows that this method is simple， efficient， specific， and reliable. The contents of free Aspartate， Glutamate， carnosine and GABA in rat's brain were (0.77±0.04)，(1.16±0.07)，(0.36±0.05)，(1.30±0.06) mg/g.
Key words：Aspartate; Glutamate; GABA; fluorescence; O-phthalaldehyde
谷氨酸(glutamate，Glu)、天冬氨酸(Aspartate，Asp)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid ， GABA)是哺乳类动物中枢神经系统内重要的氨基酸类神经递质。Glu、Asp为兴奋性神经递质，参与神经元通信到神经可塑性及神经病理异常等一系列病理生理过程[1]。GABA为抑制性神经递质，其抑制效应在于防止兴奋性神经元过度兴奋[2]。肌肽(carnosine，Car)由肌肽合成酶利用β-丙氨酸和L-组氨酸合成。尽管越来越多的研究表明，肌肽与多种疾病，如阿尔茨海默病[3]、脑缺血性疾病[4]等密切相关，但其在生物体内发挥的作用及含量的变化尚未清楚[5]。观察兴奋性神经递质和抑制性神经递质的变化以及肌肽含量的影响是将要研究的另一重要课题。为此建立了一种利用邻苯二甲醛(O-phthalaldehyde ， OPA)为衍生剂，选用常用C18柱来分离检测这四种物质的HPLC方法。结果表明该方法灵敏可靠，专属性强，重现性好，适合用于检测脑组织中游离天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽以及γ-氨基丁酸。
1 仪器与试药
1.1 仪器
高效液相色谱仪(包括LC-10Avp泵、柱温箱、荧光检测器及柱温箱等)，日本岛津;KQ-250超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;SONICS Uibra Cell VCX 105 型超声波粉碎机，美国;Mikro 22R型冷冻离心机，德国。
1.2 试剂与动物
天门冬氨酸(上海康达氨基酸厂)、谷氨酸(上海康达氨基酸厂) 、GABA(国药集团化学试剂有限公司)、肌肽和邻苯二甲醛(OPA)为sigma公司产品。乙腈为色谱纯;其余试剂均为国产分析纯。昆明种大鼠，体重240～260 g，雌雄各半，由辽宁医学院动物中心提供。
2 方法与结果
2.1 溶液的配置
对照品溶液的制备 分别称取天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽以及GABA对照品10.8、10.1、10.0和9.9 mg，混合加水稀释，即得1.08、1.01、1.00和0.99 μg/mL的标准溶液，每50 μL的标准溶液加1 μL的三氟乙酸，配成对照溶液。
供试品溶液的制备 取大鼠脑组织20 mg左右，加入纯水500 μL后，超声粉碎5个循环，每个循环为10 s，间隔10 s，强度为90%，再加入10 μL的三氟乙酸，涡旋2 min，以12 000 r/min离心20 min，分离上清，上清过0.22 μm微孔滤膜，为供试品溶液。
2.2 对照品与供试品的衍生化
OPA衍生化溶液的配制：称取OPA 10.0 mg，加甲醇1.0 mL，pH 11的0.04 mol/L硼酸缓冲溶液9 mL，二巯基乙醇40 μL，混匀避光保存。当日使用。
衍生化方法：取对照品溶液40 μL，加入OPA衍生化溶液40 μL，混匀避光2 min内，取10 μL进样。
取供试品溶液40 μL，加入OPA衍生液40 μL，混匀避光反应，进样10 μL。
2.3 色谱条件
色谱柱：Kmmail c18(250 mm×4.6 mm，5cm);流动相A为3%乙腈的磷酸盐缓冲液(25.0 mmol/L，pH=6.8)，流动相B为50%乙腈的磷酸盐缓冲液，梯度洗脱(表1)，流速1 mL/min;荧光检测波长425 nm，激发波长338 nm。柱温：38 ℃ ;进样量10 μL。表1 梯度洗脱条件
2.4 方法学研究
2.4.1 专属性
天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽以及γ-氨基丁酸对照品与供试品按照含量测定色谱条件进行实验，色谱图见图1和2。表明供试品中杂质不干扰天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽以及γ-氨基丁酸含量的测定。
2.4.2 标准曲线 稳定性 检测线
取6.00，4.00，2.00，1.00，0.75，0.50 μg/mL的混合对照品溶液，依法衍生后，各取10 μL，分别进行液相色谱仪测定，以对照品浓度(x，μg/mL)为横坐标，以相应的峰面积(y)为纵坐标，进行回归分析，四种对照品的回归方程分别为：天门冬氨酸y=106x-71462，谷氨酸y=106x-56537，肌肽y = 413586 x - 1023.3，γ-氨基丁酸y=106x -48052。相关系数分别为：0.9991，0.9998，0.9996，0.9995。说明四种对照品天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽以及γ-氨基丁酸在6.00～0.50 μg/mL内与峰面积呈良好的线性关系。
2.4.3 回收率
取已知含量的不同样品组织，分别准确加入对照品，制备供试品溶液，衍生化后进行测定，结果见表2。本法四种对照品的回收率在99.34%～99.80%之间。表2 对照品天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽以及γ-氨基丁酸的回收率(n=3)
2.5 大鼠脑组织中三种氨基酸含量的测定
取大鼠脑组织30～50 mg，加入蒸馏水500 μL后，超声粉碎5个循环，每个循环为10 s，间隔10 s，强度为90% ，再加入10 μL的三氟乙酸，涡旋2 min，以12 000 r/min离心20 min，分离上清，上清过0.22 μm微孔滤膜，取40 μL加入OPA衍生液40 μL，混匀避光反应，进样10 μL。按外标法以峰面积计算四种氨基酸的含量，结果见表3。表3 大鼠脑组织中天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽以及γ-氨基丁酸的含量(n=6)
3 讨 论
本法只用常用的C18色谱柱、双泵和荧光检测器，同时对大鼠脑组织中的天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽及γ-氨基丁酸的含量进行了分离检测，方法简单易行。参考其他氨基酸的流动相分离条件，都是分别对天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽及γ-氨基丁酸进行了检测，并没用同时测定四种物质含量的可靠HPLC检测方法。本次实验主要是在流动相的配置和梯度的选择做了进一步的完善，此方法分离最佳，效果最优。
参考文献
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