作者：温晓竞 温晓艳 陈立锋 马建伟
【摘要】 目的：观察大鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)中钙调神经磷酸酶(CaN)活性的变化，以及参麦注射液(SMI)对其的影响。方法：24只大鼠随机分为3组(n=8)：假手术组、心肌缺血再灌注模型组和参麦注射液治疗组，检测各组在缺血30min，再灌注2h后心肌CaN的变化。结果：模型组大鼠与假手术组相比，心肌CaN 活性明显升高(P&<0.01);与模型组相比，参麦治疗组大鼠心肌CaN 活性明显降低(P&<0.01)。结论：参麦注射液可以抑制大鼠心肌的CaN 活性，从而对缺血再灌注心肌起到保护作用。
【关键词】 参麦注射液;心肌缺血;再灌注损伤
【ABSTRACT】Objective:To investigate the effects of Shenmai injection(SMI)on activity of calcineurin during myocardium ischemia-reperfusion in rats.Methods:24 rats were pided randomly into 3 groups(n=8):sham-operated group，myocardial ischemia-reperfusion(MIR)model group and SMI group.The activity of calcineurin(CaN)was checked after 30 minutes ischemia and 2 hours reperfusion.Results:Compared with that of sham-operated group，the activity of CaN increased significantly(P&<0.01)in MIR model group;and compared with that of MIR model group，the activity of CaN decreased significantly(P&<0.01)in SMI group.Conclusion:Shenmai injection can protect the myocardial function by decreasing CaN activity on ischemia-reperfusion myocardium in rats.
【KEY WORDS】Shenmai injection，Myocardial ischemia，Reperfusion injury
目前，临床上运用经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)、冠状动脉旁路搭桥手术和溶栓等手段来治疗急性心肌梗死(AMI)，使缺血心肌在短时间内恢复血供，及时清除代谢废物并提供氧气和营养物质，有利于减轻缺血损伤，使AMI 的治愈率和生存率得到显著提高。但是，某些情况下再灌注后可出现严重的心律失常和心功能不全，即出现心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)。因此，如何防止MIRI产生或减轻其程度就成为一研究热点。参麦注射液(Shenmai injection，SMI)源自《症因脉治》的参麦饮，是将红参和麦冬经过加工、提取、精制而成的注射液，具有益气养阴、生津复脉之功效。有临床研究[1]报道，在AMI患者溶栓治疗同时静滴参麦注射液，可有效改善心肌微循环，增强心功能，降低心律失常的发生率和住院期间死亡率。但有关参麦注射液的保护作用机制研究仍较少。钙调神经磷酸酶(calcineurin，CaN)是一种受Ca2+/钙调素(calmodulin，CaM)调节的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶，在体内分布广泛，作为多功能信号酶，参与多种细胞的信号转导和功能调节。有研究表明，CaN介导了MIRI中的心肌细胞凋亡[2]，而也有实验证实参麦注射液能有效减轻缺氧-复氧心肌细胞内Ca2+的超负荷，减少细胞凋亡的发生[3]。但参麦注射液对CaN的影响尚未见报道。本实验从心肌CaN活性变化方面探讨了参麦注射液对急性缺血再灌注心肌的影响，从而为其临床应用提供科学的实验依据。
1材料和方法
1.1实验动物分组
健康Wistar大鼠(体重180~220g)24只，雌雄不拘，购自中国科学院动物研究所维通利华实验动物中心。大鼠适应性喂养1周后心电图正常者作为实验对象，其他一般情况具有可比性，差异无统计学意义。随机将其分为三组：假手术组(sham-operated group)、缺血再灌注模型组[myocardial ischemia-reperfusion(MIR)model group]和参麦注射液治疗组[Shenmai injection(SMI)group]，每组8只。
1.2实验仪器、药品和试剂
756MC紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);Labofuge 400型高速低温离心机(德国科俊);DHX-150型动物呼吸机(成都仪器厂)。参麦注射液(每支10mL，含红参、麦冬生药各1g，神威药业有限公司生产);氨基甲酸乙酯(北京化学试剂公司);CaN测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
1.3动物模型制备
参照文献[4]的方法，稍加改良。先从腹腔注射20%氨基甲酸乙酯(5mL/kg)麻醉大鼠，后将其仰卧固定于鼠板，颈部手术分离气管，进行气管插管，并连接动物呼吸机，实行正压人工呼吸。将针形电极插入四肢皮下，记录标准肢体Ⅱ导联心电图。开胸暴露心脏，用4/0连线圆针从左心耳下1mm处浅层心肌穿过。假手术组：只穿线不结扎，2.5h后取材检测;心肌缺血再灌注模型组：在心肌和结扎线之间放置直径约2mm的医用硅胶管后结扎冠状动脉左前降支(LAD)，以心电图Ⅱ导S-T段明显抬高，且结扎线下部心肌颜色明显变暗为模型制备成功，缺血30min后松开结扎线施行再灌注，与此同时从股静脉注射生理盐水(10mL/kg)，再灌注2h后观察结果;参麦注射液治疗组：与模型组的区别是再灌注同时从大鼠股静脉注射参麦注射液(剂量为10mL/kg)。
1.4观察项目
摘取各组大鼠心脏，取结扎线下方一小块左心室心肌，于冰冷(0～4℃)的生理盐水中洗去血液，用滤纸吸干水分，称取0.1g心肌，用0～4℃生理盐水制成10%的组织匀浆液，以3 000r/min的速度低温(4℃)离心15mim，取上清液，用CaN试剂盒测定心肌组织CaN活性。
1.5统计学处理
使用SPSS统计软件，所测数据以平均值±标准差(x±s)表示，两组间的数据比较采用t检验，P&<0.05为差异有显著性。
2结果
检测结果显示，心肌缺血再灌注模型组的心肌组织CaN活性明显高于假手术组(P&<0.01)，而参麦注射液治疗组的CaN活性显著低于模型组(P&<0.01)(表1)。表1参麦注射液对大鼠心肌组织CaN活性的影响
3讨论
参麦注射液由红参和麦冬两味药组成，具有益气固脱、滋阴生津、养阴复脉之功效。红参性甘微苦、温，归脾、肺经;麦冬性甘微苦、寒，归肺、胃、心经。大量的动物实验证实，红参和麦冬具有保护心肌毛细血管内皮细胞，减轻线粒体损伤，促进心肌细胞DNA合成的作用，可扩张冠脉血管，增加冠脉血流量;显著提高动物的耐缺氧能力，改善心肌收缩力和心脏功能，对心肌缺血有显著的保护作用。因此，用红参和麦冬制成的注射液，其药性相辅相成，能够改善心肌的营养性血液供应和新陈代谢，增强机体对缺血、缺氧的耐受能力。临床研究发现，在使用尿激酶溶栓治疗AMI的同时静滴参麦注射液，可明显降低患者室性早搏、阵发性室速和加速性室性自主心率的发生率[5]。另外，陈民等[6]还观察到，应用同样手段治疗AMI患者，能使梗塞后心力衰竭、心绞痛及休克的发生率大幅减小。本实验采用结扎LAD30min，再灌注2h的方法复制MIRI模型，并且在再灌注同时静脉推注参麦注射液，与临床治疗手段类似。
MIRI是多种病理因素共同作用的结果。很多实验和临床研究都证实一氧化氮(nitric oxide，NO)、一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)和内皮素(endothelin，ET)在MIRI中起到了至关重要的作用，而且细胞内Ca2+超载也是MIRI时的关键性病理变化之一。CaN在信号转导中作为Ca2+的下游信号分子，起去磷酸化作用，广泛参与细胞的多种功能调节。现已明确，心肌细胞内钙离子浓度的升高，可激活细胞内钙敏信号途径，其中包括Ca2+/ CaM依赖的CaN途径[7]。有研究[8]显示CaN可激活NF-kB，使之转位入核，诱导巨噬细胞、心肌细胞和上皮细胞等的诱导型NOS(induced NOS，iNOS)表达。iNOS致使大量NO产生，NO立即生成氧自由基，可抑制心肌舒缩，甚至促进心肌细胞。还有实验[9]表明肾上腺素等β受体激动剂引起的心肌ET-1表达增加由CaN/GATA4介导。ET可促使细胞水肿，增加心肌的脂质过氧化;还可引起持续性冠脉痉挛，造成心肌严重缺血缺氧而坏死凋亡。并且李文霞等[10]研究也发现CaN的过表达明显增加了MIRI中的心肌细胞凋亡率。
实验结果显示，CaN在心肌缺血再灌注过程中活性增强，且参麦注射液的干预作用可使CaN活性降低。另外，本实验同时也检测了血中NO、NOS以及ET的变化，发现大鼠MIRI后血中iNOS的活性和ET水平明显升高，参麦注射液可抑制iNOS活性并降低ET水平[11]。故推测，参麦注射液减轻MIRI的机制可能与减弱心肌CaN的活性，从而减少iNOS和ET的表达以及心肌细胞的凋亡有关。
综上所述，在大鼠心肌缺血再灌注的同时注射参麦注射液能减轻心肌损伤，其信号转导过程可能与CaN密切相关，至于其详细机制仍有待进一步研究。
参考文献
1于凤霞，李翠萍.参麦注射液防治心肌缺血再灌注损伤的临床疗效与机理\[J\].医学理论与实践，2004，17(10):1149-1150.
2Bueno OF，Lips DJ，Kaiser RA，et al.Calcineurin Abeta gene targeting predisposes the myocardium to acute ischemia-induced apoptosis and dysfunction\[J\].Circ Res，2004，94(1):91-99.
3郝然，陈彦静，黄启福.参麦注射液对急性缺氧-复氧心肌细胞凋亡的影响\[J\].中国病理生杂志，2005，21(8):1524-1527.
4徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学\[M\].第3版.北京：人民卫生出版社，2002.1052-1054.
5张金芳.参麦注射液治疗急性心肌梗死再灌注心律失常观察\[J\].实用医技杂志，2007，14(25):3505-3506.
6陈民，赵刚，董丽.参麦注射液对尿激酶静脉溶栓治疗急性心肌梗塞再灌注性损伤的防治\[J\].中国急救医学，1999，19(5):287.
7韩笑，刘建勋.心肌缺血再灌注损伤的细胞信号转导机制\[J\].中国药理学通报，2004，20(1)：4-7.
8Kim Y，Moon JS，Lee KS，et al.Ca2+/ calmodulin-dependent protein phosphatase calcineurin mediates the expression of iNOS through IKK and NF-kappaB activity in LPS-stimulated mouse peritoneal macrophages and RAW 264.7 cells\[J\].Biochem Biophys Res Commun，2004，314(3):695-703.
9Morimoto T，Hasegawa K，Wada H，et al.Calcineurin-GATA4 pathway is involved in β-adrenergic agonist-responsive endothelin-1 transcription in cardiac myocytes\[J\].J Biol Chem，2001，276(37):34983-34989.
10李文霞，沈小梅，陈侠，等.钙调神经磷酸酶在老龄大鼠心肌缺血再灌注损伤所致细胞凋亡中的作用\[J\].西医结合">中西医结合心脑血管病杂志，2009，7(9)：1067-1069.
11温晓竞，朱秀燕，张敏，等.参麦注射液对大鼠心肌缺血再灌注中一氧化氮、一氧化氮合酶和内皮素的影响\[J\].陕西中医，2009，30(12)：1680-1681.