FGF23过表达对小鼠肾、肝和海马中SOD、GSHPX活力和MDA含量的影响

【摘要】 目的：研究成纤维细胞生长因子(FGF)23过表达对小鼠肾、肝和海马组织中氧化及抗氧化系统的影响，探讨FGF23过表达致衰老的可能机制。方法：采用8周龄过表达人FGF23转基因小鼠模型，检测转基因和野生型小鼠血清磷水平，测定肾、肝和海马组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)的活力以及丙二醛(MDA)的含量。结果：与野生型小鼠相比，FGF23转基因小鼠血清磷水平显著降低(P&<0.001);肾组织中SOD和GSHPX的活力均显著降低(P&<0.001)，MDA的含量显著升高(P&<0.001);海马组织中SOD和GSHPX的活力明显降低(P&<0.05或P&<0.01)，MDA的含量明显升高(P&<0.01)。肝组织中SOD、GSHPX的活力和MDA的含量与野生型小鼠相比差异不显著(P&>0.05)。结论：FGF23过表达能够导致肾和海马组织氧化损伤，FGF23过表达致衰老与这些组织中氧化与抗氧化系统的失衡有一定的关系。

【关键词】 成纤维细胞生长因子23; 超氧化物歧化酶; 谷胱甘肽过氧化物酶; 丙二醛; 衰老

　　[Abstract] Objective: To investigate the effects of fibroblast growth factor(FGF)23 overexpression on oxidant and antioxidant systems in mouse renal， hepatic and hippocampal tissues in order to elucidate the mechanism of aging caused by FGF23 overexpression. Methods: The serum phosphate levels， superoxide dismutase(SOD) and glutathione peroxidase(GSHPX) activity and malondialdehyde(MDA) contents were measured and analyzed by the comparison of eightweekold transgenic mice overexpressing human FGF23 to their agematched wildtype littermates. Results: Compared with the wildtype littermates， serum phosphate level of FGF23 transgenic mice was decreased significantly(P&<0.001); SOD and GSHPX activity were reduced significantly(P&<0.001)， MDA content was increased significantly(P&<0.001) in renal tissue; SOD and GSHPX activity were decreased significantly(P&<0.05 or P&<0.01) while MDA content was increased significantly(P&<0.01) in hippocampal tissue. However， there were no significant differences in SOD and GSHPX activity and MDA contents in hepatic tissues between these two groups(P&>0.05). Conclusion: FGF23 overexpression can result in oxidant injury in renal and hippocampal tissues which may be contributed to the aging caused by FGF23 overexpression.

　　[Key words] fibroblast growth factor23; superoxide dismutase; glutathione peroxidase; malondialdehyde; aging

　　成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor， FGF)23是多肽激素FGF家族的新成员，是近年来发现的一种新型调磷因子[1]。FGF23过表达能够导致低磷血症。过表达人FGF23(R176Q)的转基因小鼠由于FGF23 R176Q位点错义突变，FGF23的半衰期延长，在体内的生物活性得到提高，因而其患有的低磷血症和佝偻病/骨软化症的程度要比表达野生型FGF23的小鼠严重得多[2-3]。我们在研究中发现，过表达人FGF23(R176Q)的转基因小鼠脑部较小，并表现出衰老的特征，如出生后生长迟缓、骨质疏松、皮肤角化过度，且于生后2～3个月内死亡[4]。FGF23过表达致衰老是否与机体氧化及抗氧化系统的改变有关尚不清楚。本实验研究FGF23过表达对小鼠肾、肝和海马组织中氧化及抗氧化系统的影响，探讨FGF过表达致衰老的可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　过表达人FGF23(R176Q)的转基因和野生型小鼠(SPF级)由南京医科大学骨与干细胞研究中心提供，采用FGF23转基因雄鼠和野生型雌鼠配对饲养，所有仔鼠的基因型通过剪尾(2～5 mm)提取DNA进行PCR扩增鉴定，8周龄时用于实验研究。每组8只，雌雄各半，采用同窝同性别配对。FGF23基因引物序列：上游5′CTCTGGGTCTGTGCCTTGTGC3′，下游5′GGAGTACGG

　　GGGTGGGTTCAT3′，PCR扩增片段长度为444 bp。内参GAPDH引物序列：上游5′CATTTCACTCAAGGTTGT

　　CAGC3′，下游5′ATCATACTTGGCAGGTTTCTCC3′，PCR扩增片段长度为346 bp。引物由上海Invitrogen公司合成。

　　1.2 血清磷检测

　　两组动物经电子天平称质量后，7.5%(5 μl·g-1)水合氯醛腹腔注射麻醉，剥离胸部皮肤，经胸腔外心脏穿刺取血，4 000×g离心5 min，取上清制成血清样本，按磷检测试剂盒要求检测血清磷水平。无机磷检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

　　1.3 组织匀浆制备与超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)活力和丙二醛(MDA)含量测定 动物经脱颈处死后，打开腹腔取出肾、肝，断头取脑，迅速分离海马，将肾、肝、海马置于冰上，称质量后加入预冷的生理盐水，按试剂盒要求制备组织匀浆。SOD和GSHPX活力检测分别采用黄嘌呤氧化酶比色法和还原型谷胱甘肽消耗法，MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法，测试仪器为上海尤尼科V2102型分光光度计。组织蛋白定量按考马斯亮兰试剂盒说明书测定。上试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

　　1.4 统计学处理

　　检测所得数据以±s表示，采用t检验进行统计学处理，P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 基因型鉴定结果

　　基因型鉴定结果显示，野生型小鼠只有346 bp条带，因为其PCR产物中仅有内参GAPDH;转基因小鼠有346 bp和444 bp两个条带，因为其PCR产物中还含有人FGF23。见图1。

　　2.2 FGF23过表达对血清磷水平的影响

　　为了明确FGF23过表达对血清磷的影响，我们通过血液生化检测观察了FGF23转基因与野生型小鼠血清磷水平的变化。检测结果显示转基因小鼠血清磷水平较野生型小鼠显著降低[(1.20±0.18)vs(2.36±0.12) mmol·L-1，P&<0.001，图2]。我们的结果再次证实FGF23过表达导致了重度低磷血症。

　　与野生型小鼠相比，a P&<0.001

　　图2 FGF23过表达对血清磷水平的影响

　　Fig 2 Effect of FGF23 overexpression on serum phosphate level2.3 FGF23过表达对小鼠肾、肝和海马组织SOD活力的影响 与野生型小鼠相比，FGF23转基因小鼠肾组织中SOD活力显著降低(P&<0.001)，海马组织SOD活力也明显降低(P&<0.01)，而肝组织中SOD活力无明显变化(P&>0.05)。见表1。表1 FGF23过表达对小鼠肾、肝和海马组织SOD活力的影响

　　与野生型小鼠相比，a P&<0.001， b P&<0.012.4 FGF23过表达对小鼠肾、肝和海马组织GSHPX活力的影响 FGF23转基因小鼠海马组织GSHPX的活力较野生型小鼠明显降低(P&<0.05)，而肾组织中GSHPX的活力降低更为显著(P&<0.001)。肝组织中GSHPX的活力与野生型相比差异不显著(P&>0.05)，但有下降趋势。见表2。表2 FGF23过表达对小鼠肾、肝和海马组织GSHPX活力的影响

　　与野生型小鼠相比，a P&<0.001， b P&<0.052.5 FGF23过表达对小鼠肾、肝和海马组织MDA含量的影响 与野生型小鼠相比，FGF23转基因小鼠肾组织MDA的含量显著升高(P&<0.001)，海马组织MDA的含量也明显升高(P&<0.01)。肝组织中MDA的含量虽有一定程度的升高，但与野生型相比无统计学差异(P&>0.05)。见表3。表3 FGF23过表达对小鼠肾、肝和海马组织MDA含量的影响

　　3 讨 论

　　目前，关于衰老机制的学说种类很多，自由基学说是衰老机制研究中最为活跃的领域之一。在病理情况下，机体内的氧化与抗氧化系统之间的平衡被打破，内源性自由基生成异常增多，抗氧化功能减弱，不能被清除的氧自由基不断累积且活性升高，导致细胞膜脂质过氧化。自由基氧化可能是导致衰老、细胞损伤和退行性变的主要原因[5]。MDA含量和SOD、GSHPX活力是研究和评价氧化与抗氧化水平的常用指标。MDA是脂质过氧化反应的终产物之一，其含量高低反映脂质过氧化的程度。SOD和GSHPX是机体抗氧化系统的重要组成部分，能够抑制脂质过氧化反应或使过氧化物分解[6]，因而它们的活性大小反映机体抗氧化的能力。

　　为了明确FGF23过表达对小鼠氧化和抗氧化系统的影响，我们检测了小鼠肾、肝和海马组织中SOD和GSHPX的活力以及MDA的含量，结果表明，与野生型小鼠相比，FGF23转基因小鼠肾和海马组织SOD和GSHPX的活力明显下降，MDA的含量显著升高，其中尤以肾组织中相关指标的变化最为明显，这可能与肾脏是FGF23主要的靶器官有关[7-8]。海马是哺乳类动物学习和记忆的重要脑区。有实验证明，小鼠学习记忆能力的优劣在一定程度上和海马自由基损伤的程度有关[9]。本实验的结果表明，FGF23转基因小鼠海马组织抗氧化能力降低以及脂质过氧化，提示该转基因小鼠可能还存在空间学习记忆功能障碍，我们先前的Morris水迷宫实验结果也证实了这一推测(结果另文发表)。FGF23的作用与FGF家族的大多数成员不同[10]，MDA含量的升高从一个侧面反映了FGF23过表达后的毒性作用，另外，MDA的异常累积也是抗氧化酶活力下降后清除不力的结果。本实验发现，肝组织中SOD和GSHPX的活力以及MDA的含量较野生型小鼠无明显变化，表明肝脏可能是一个在氧化损伤过程中代偿能力更强的器官，亦或不同的组织器官对FGF23毒性作用的反应不尽相同。

　　过表达人FGF23的转基因小鼠肝脏产生FGF23[2]。FGF23通过与其复合受体结合从而发挥功能，除肾外，研究发现垂体、脉络丛、窦房结和甲状旁腺可能也是FGF23的靶器官[10-12]。另一方面，作为重要的调磷因子，FGF23通过对肾的作用导致肾排磷增加。FGF23过表达对小鼠氧化和抗氧化系统的影响是FGF23经过其肾外受体介导的直接作用，还是低磷血症介导的间接作用的结果还有待进一步的研究。

　　综上所述，我们以过表达人FGF23(R176Q)的转基因小鼠为实验动物，观察了FGF23过表达对机体氧化与抗氧化系统的影响，证明FGF23过表达能够导致肾和海马组织氧化损伤，FGF23过表达致衰老与这些组织中氧化与抗氧化系统的失衡有一定的关系。本研究为常染色体显性遗传性低磷血症性佝偻病(ADHR)、X连锁低磷血症性佝偻病/骨软化症(XLH)等临床FGF23过表达疾病的研究提供了实验和理论依据。

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