机械通气对急性肺损伤大鼠炎症反应的影响

　　　　 作者：叶正龙 徐巧莲 李士荣 邹辉 邱海波

【摘要】 目的：评估不同潮气量对急性肺损伤（ＡＬＩ）大鼠炎症反应的影响。方法： 雄性SD大鼠30只，随机分为对照组、ALI组、小潮气量（LV）组、传统潮气量（NV）组及高潮气量（HV）组5组。机械通气4 h后，进行肺组织病理切片Smith评分、肺水含量（W/D）测定、肺通透性（ＬＰＩ）测定（放免法测定血浆及肺泡灌洗液中125I白蛋白含量，计算两者比值），ELISA法测定肺泡灌洗液中TNFα、IL10含量。结果： Smith评分、W/DLV组较ALI、NV、HV组显著减轻。肺泡灌洗液中TNFα、IL10含量LV组较NV、HV组显著减低。结论： 小潮气量机械通气能减轻肺部炎症反应，从而减轻肺组织损伤，对ALI 具有保护作用。

【关键词】 急性肺损伤 机械通气 炎症反应 大鼠
　　
　 Abstract： Objective To evaluate the influence of ventilation with different tidal volume on inflammatory response in rats with acute lung injury(ALI). Methods 30 male SD rats were randomly pided into five groups: normal group， ALI group，low tidal volume(LV) group， traditional tidal volume(NV) group，high tidal volume(HV) group.After 4 hours of mechanical ventilation， lung injury was evaluated by Smith lung injury score， lung water content(wet/dry， W/D) and lung permeability index(LPI)，tumor necrosis factorα(TNFα)and interleukin10(IL10) levels in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were measured by ELISA. Results Smith lung injury score and W/D in LV group were significantly lower than those in NV group and HV group， and Smith lung injury score， W/D， and LPI in HV group was the highest of all groups. Concentration of TNFα and IL10 in LV group were significantly lower than those in NV group and HV group. Conclusion LV ventilation can inhibit inflammatory response and alleviate lung injury in rat with acute lung injury.

　　　Key words：acute lung injury; ventilation; inflammatory response； rats
　　
　　患者机械通气是治疗急性肺损伤（ALI）的重要手段，由于患者ＡＬＩ病变的不均一性和具有正常通气功能的肺泡明显减少，使得在机械通气不当时，可以加重原有的肺损伤，引起呼吸机相关性肺损伤(VILI)， 引发或加重全身炎症反应［1］。肺保护性通气策略即采用小潮气量（ＬＶ）加最佳呼气末正压对ALI者进行机械通气以避免肺泡的过度膨胀和肺泡的反复塌陷复张，防止VILI的发生。研究表明，肺保护性通气可降低ALI的病死率［2］。本实验通过研究不同潮气量机械通气对ALI大鼠肺部炎症反应的影响，从肺生物伤的角度评价肺保护性通气策略，为肺保护性通气策略的合理应用提供实验依据。

　 1 材料与方法

　 1.1 主要材料

　　　雄性SD大鼠由东南大学医学院实验动物中心提供，脂多糖（ＬＰＳ）购于Sigma公司，125I白蛋白购于北京生物技术公司，肺通透性（LPI）检测在东南大学放射免疫中心进行，小动物呼吸机（ASV0961001型）为美国Havard产品。

　 1.2 动物分组及模型制备

　 雄性SD大鼠30只，体重200～250 g，随机分为对照组、ALI组、LV组、传统潮气量（NV）组及大潮气量（HV）组5组。对照组大鼠尾静脉注射生理盐水。LV、NV及HV组潮气量分别设为6、10及15 ml·kg-1。动物称重后，腹腔注射戊巴比妥钠，仰卧位固定，鼠尾静脉注射LPS 6 mg·kg-1，制备ALI模型［3］，另一侧鼠尾静脉注射125I白蛋白0.2 ml。机械通气模式及参数：气管切开置入气管插管，连接小动物呼吸机，容量控制模式，呼吸频率40次·min-1，吸入氧浓度100%。实验开始时肌肉注射泮库溴胺2 mg·kg-1，使动物保持肌肉松弛状态。

　 1.3 标本采集

　 实验开始4 h后心内采血法处死动物，血液离心后留取血浆。分离气管，开胸取出肺脏，寻找气管分叉，结扎右侧主支气管，用冰生理盐水对左肺进行肺泡灌洗，2 ml×3次，回收率大于90%，将肺泡灌洗液(BALF)离心（1000 r·mim-1，5 min，4℃），分别留取上清液及细胞沉淀。

　 1.4 肺损伤检测指标

　　1.4.1 组织病理学

　　气管结扎后立即从右肺后叶取一块肺组织，迅速放入10%中性福尔马林中固定24 h，然后进行石蜡包埋、HE染色，用于观察肺损伤程度。采用Smith评分方法［4］对肺水肿、肺泡及间质炎症、肺泡及间质出血、肺不张和透明膜形成分别进行0～4分的半定量分析：无损伤0分，病变范围＜25%为1分，病变范围占25%～50%为2分，５０％＜病变范围＜75%为3分，病变满视野为4分，总肺损伤评分为上述各项之和。每只动物观察10个高倍视野，取其平均值。由两位病理科医师分别评分后取平均分。

　　1.4.2 肺水含量测定

　　气管结扎后取右肺中叶，吸水纸吸干表面水分及血液，称重。置于80 ℃烤箱72h后称量肺干重，计算湿干重比（W/D）。

　　1.4.3 LPI测定

　　血液及BALF离心后，取血浆及BALF少许称重后，由放射免疫中心测定血浆及BALF中125I白蛋白含量，以血浆与ＢＡＬＦ中白蛋白含量的比值来反映ＬＰＩ。

　 1.5 BALF中细胞因子测定

　 取BALF上清测定TNFα及IL10含量，严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作。

　　　1.6 统计学处理

　 应用SPSS11.5软件，数据以x±s表示，行单因素方差分析，两两比较用SNK检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　
　　2 结 果

　 2.1 肺损伤检测指标

　　2.1.1 肺组织病理检查及Smith评分

　　与对照组相比，ALI、LV、NV及HV组均可见肺泡腔及间质内白细胞渗出、浸润，肺泡腔内见渗出液，肺泡隔增厚，肺泡及间质充血，部分肺泡塌陷、不张、透明膜形成，肺泡结构破坏。其中ＨＶ组损伤最重。Smith评分（表１）显示：与对照组相比，各组评分均显著增加（P＜0.05）；与ALI组相比，LV组评分显著降低（P＜0.05），NV组无明显差异（P＞0.05）， HV组评分显著增加（P＜0.05）；与LV组相比，NV、HV组显著增加（P＜0.05）。
2.1.2 肺水含量测定 与对照组相比，各组W/D均明显升高（P＜0.05）。与ALI组相比，LV组W/D显著降低（P＜0.05），NV组W/D升高但没有统计学意义（P＞0.05），HV组W/D显著升高（P＜0.05）。见表１。

　　2.1.3 LPI测定

　　与对照组相比，HV组LPI显著升高（P＜0.05），ALI、LV、NV组ＬＰＩ均升高，但没有统计学意义（P＞0.05）。与ALI组相比，HV组LPI显著升高（P＜0.05）， LV、NV组均升高，但没有统计学意义（P＞0.05）。见表１。表1 肺损伤检测结果(略)

　　2.2 BALF中细胞因子含量测定

　　2.2.1 ＢＡＬＦ中TNFα含量测定

　　与对照组相比，各组ＢＡＬＦ中TNFα含量均显著升高（P＜0.05）。与ALI组相比， NV、HV组TNFα含量均显著升高（P＜0.05），LV组含量升高，但没有统计学意义（P＞0.05）。与LV组相比，NV、HV组TNFα含量均显著升高（P＜0.05）。见表２。表2 BALF中细胞因子含量测定结果(略)

　　2.2.２ BALF中IL10含量测定

　　与对照组相比，各组BALF中IL10含量均显著升高（P＜0.05）。与ALI组相比，NV、HV组IL10含量均显著升高（P＜0.05），LV组显著降低(P＜0.05)。与LV组相比，NV、HV组IL10含量均显著升高（P＜0.05）。见表2。

　3 讨论

　 机械通气作为目前治疗ＡＬＩ的主要手段，可明显改善氧合状况，纠正低氧血症，但呼吸机使用不当可以引起VILI。以往认为机械通气时肺内压力过高（气压伤）及肺过度膨胀（容积伤）是VILI的主要机制。近年来的研究表明，损伤性机械通气时，异常的机械力作用于肺组织，导致肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞损伤，毛细血管基底膜暴露，激活炎症细胞，产生大量炎症介质，导致肺内炎症加剧，加重肺损伤，即肺“生物伤”［5］是VILI发生的重要机制之一。

　 许多研究表明 ［67］，TNFα等细胞因子激活中性粒细胞(PMN)，增强PMN与血管内皮细胞的黏附，促使PMN迁移至炎症部位，使肺组织中的PMN大量聚集和激活，释放氧自由基、蛋白水解酶等，引起组织损伤，导致VILI的发生。肺保护性通气策略通过防止肺泡过度膨胀和肺泡反复塌陷复张，可以减轻对肺内炎症细胞的机械刺激，使局部细胞因子的分泌水平降低，肺部炎症反应减轻。

　　Ranieri等［8］将44例急性呼吸窘迫综合征患者随机分为两组，1组进行传统机械通气（平均潮气量11.1 ml·kg-1），1组接受保护性通气(平均潮气量7.6 ml·kg-1)，监测两组病人血浆和BALF中细胞因子含量，结果发现，保护性通气组患者BALF中的中性粒细胞、TNFα、IL6、IL8等因子的浓度明显低于传统组患者。Tremblay等［9］用高潮气量(40 ml·kg－1)给大鼠通气2 h后发现，大鼠BALF中TNFα、IL6、IL1β含量均明显增加。实验证明，高潮气量有促进致炎因子向气道及血中释放、促使PＭＮ向肺中渗透以及肺巨噬细胞激活的作用［10］，而PＭＮ聚集是ALI肺部炎症的特征性标志［11］。本实验亦表明ＮＶ及ＨＶ组机械通气较ＬＶ组明显增加BALF中TNFα的含量。

　 机体炎症反应包括抗炎反应及促炎反应两个方面，ALI被认为是促炎反应与抗炎反应失衡的结果。Tremblay等［9］研究显示，随着潮气量的增大，ＢＡＬＦ中IL10含量增加。高潮气量不仅加重肺部炎症反应，也加重肺部抗炎反应，肺保护性通气策略可减轻肺部抗炎反应。IL10作为一种重要的抗炎细胞因子，在机体抗炎反应中有重要作用。本实验提示，小潮气量通气不但抑制肺部促炎因子TNFα产生，而且抑制抗炎因子IL10产生，有利于维持肺部促炎反应与抗炎反应之间的平衡，减轻组织损伤，邱海波等［12］的研究也证实了同样的结果。

　 VILI是临床关注的重点课题，目前发生机制尚不很清楚，涉及宿主及遗传因素、机械应力及炎症反应等。了解不同潮气量机械通气时肺部炎症反应的情况，从炎症性损伤的发生机制着手，调控免疫反应，可能也是防治VILI的重要手段［13］。

　　　本实验结果提示，小潮气量机械通气能减轻肺部炎症反应从而减轻肺组织损伤，对ALI 具有保护作用。

参考文献

　　［1］SLUTSKY A　S， TREMBLAY L N. Multiple system organ failure. Is mechamical ventilation a contributing factor?［J］. Am J Respir Crit Care Med，1998，157:17211725.

　　［2］LAFFEY J G， KAVANAGH B P. Ventilation with lower tidal volumes as compared with traditional tidal volumes for acute lung injury［J］. N Engl J Med， 2000， 343(5): 812813.

　　［3］李琦，钱桂生，张青，等.不同剂量脂多糖对大鼠急性肺损伤效应的观察［J］.第三军医大学学报，2004，26（10）：871873.

　　［4］SMITH K M，MROZEK J D， SIMONTON S C， et al. Prolonged partial liquid ventilation using conventional and highfrequency ventilatory techniques: gas exchange and lung pathology in an animal model of respiratory distress syndrome［J］. Crit Care Med， 1997， 25(11): 18881897.

　　［5］邱海波，陆晓昱.呼吸机相关肺损伤的炎症反应机制［J］.基础医学与临床，2003，23（6）:589594.

　　［6］MEDURI G U， HEADLEY S，KOHLER G， et al. Persistent elevation of inflammatory cytokines predicts a poor outcome in ARDS. Plasma IL1 beta and IL6 levels are consistent and efficient predictors of outcome over time［J］.Chest，1995，107(4): 10621073.

　　［7］GOODMAN R B， STRIETER R M， MARTIN D P， et al. Inflammatory cytokines in patients with persistence of the acute respiratory distress syndrome［J］. Am J Respir Crit Care Med， 1996， 154(9): 602611.

　　［8］RANIERI V M， SUTER P M， TORTORELLA C， et al. Effect of mechanical ventilation on inflammatory mediators in patients with acute respiratory distress syndrome: a randomized controlled trial［J］. JAMA，1999， 282(7): 5461.

　　［9］TREMBLAY L， VALENZA F， RIBEIRO S P， et al. Injurious ventilatory strategies increase cytokines and cfos mRNA expression in an isolated rat lung Model［J］. J Clin Invest， 1997， 99(3): 944952.

　　［10］IMANAKA H， SHIMAOKA M， MATSUURA N， et al. Ventilatorinduced lung injury is associated with neutrophil infiltration， macrophage activation， and TGFbeta 1 mRNA upregulation in rat lungs［J］. Anesth Analg， 2001， 92(2): 428436.

　　［11］杨颖乔，刘晓晴.血管内皮细胞与急性肺损伤［J］.中国急救医学，2004，24（6）：434437.

　　［12］邱海波，燕艳丽，杨毅，等.肺保护性通气对急性呼吸窘迫综合征兔肺炎症反应的影响［J］.中华呼吸和结核杂志，2004，27(5)：298301.

　　［13］TAMS D， NAFTALI K. Gene expression profiling of target genes in ventilatorinduced lung injury［J］. Physiol Genomics， 2006，26(9): 6872.