肝纤维化发展及逆转过程中RECK基因表达与MMP2活性相关性的研究

　　　　 作者：郭珊珊，吴楠，李静，刘东风，陈平圣

【摘要】 　　目的：了解肝纤维化发展和逆转过程中RECK基因表达与基质金属蛋白酶2(MMP2)活性之间的相关性。方法：SD雄性成年大鼠随机分为对照组和肝纤维化组，用CCl4皮下注射建立肝纤维化模型。8周后，肝纤维化组随机分为肝纤维化进展组和肝纤维化自然逆转组，前者继续予CCl4注射，后者停用CCl4。采用天狼猩红染色判断肝纤维化程度，明胶酶谱法检测肝组织MMP2的活性，RTPCR法检测RECK基因的表达情况。结果：MMP2的活性随肝纤维化程度的加重而逐渐升高，而肝纤维化逆转时则随时间推移MMP2的活性逐渐下降；而RECK的变化相反，RECK表达和MMP2的活性呈负相关(P＜0.05)。结论：在大鼠肝纤维化发展和逆转过程中，RECK表达与MMP2活性可能有密切关系，前者对后者可能起抑制作用。

【关键词】 RECK基因； 肝纤维化； 基质金属蛋白酶2； 大鼠
　　
　　［Abstact］ Objective：To investigate the relation between RECK expression and matrix metalloproteinase2(MMP2) activity in the development and the reversion process of hepatic fibrosis in rats.Methods：Spraque Dawley male rats were randomly pided into control group and hepatic fibrosis group.The hepatic fibrosis model was induced by CCl4 in the experiment group.Eighth weeks later， the hepatic fibrosis group were randomly pided into two groups， including hepatic fibrosis development group which were keep on induced by CCl4 and hepatic fibrosis reversion group which were stopped using CCl4.The collagen deposition，MMP2 activity and RECK expression in the liver tissues were detected by Sirius red staining，zymography and RTPCR respectively.Results：It was found that MMP2 activity increased gradually in the development process of the hepatic fibrosis，and descended in the reversion process.But RECK expression was reversed change at the same time.And negative correlation between RECK expression and MMP2 activity in the liver tissues(P&<0.05).Conclusions：MMP2 activity and RECK expression may be closely related in the development and reversion process of hepatic fibrosis.RECK maybe have an depressant effect on MMP2 activity.

　　［Key words］ RECK gene； hepatic fibrosis； matrix metalloproteinase2； rats

　　RECK基因(reversioninducingcysteinerich protein with Kazal motifs，RECK)是1998年Takahashi等［1］在vKiras转染的NIH3T3细胞中发现的一种新基因，该基因编码的蛋白能在转录后水平抑制至少3种基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)，即MMP2、MMP9和膜型基质金属蛋白酶1(membrane type 1matrix metalloproteinase，MT1MMP)。在肝纤维化发生发展过程中主要表现为细胞外基质(extracellular matrix，ECM)合成过多和降解减少，而基质金属蛋白酶对ECM有广泛的降解作用，是调节ECM动态平衡的最重要的一大酶系［2-3］。MMP2通过影响肝星状细胞活化、促进血管生成以及肝窦毛细血管化等关键环节参与肝纤维化发生发展。因此，在肝纤维化病程的不同阶段，干预该酶的表达和活性有可能延缓此病的发展，在肝纤维化发生发展过程中RECK基因对MMP2活性是否有调节作用尚未见相关报道，为此，作者进行动物实验，对其活性调节机制作一探讨。
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 实验动物与试剂
　　
　　SD雄性成年大鼠65只(购自上海斯莱特公司)，体重(140±10) g。天狼猩红购自北京索莱宝科技有限公司，MMP2酶谱检测试剂盒购自北京普利莱生物试剂公司，RTPCR试剂盒购自TaKaRa公司。
　　
　　1.2 方法

　　1.2.1 SD大鼠肝纤维化模型的建立

　　参照肖柳斌等［4］的方法略加修改，将65只SD雄性成年大鼠分为两组：其中对照组5只，每周2次予纯花生油（3 ml·kg-1）皮下注射，第8周处死；肝纤维化组60只，每周2次予50%CCl4油溶液（3 ml·kg-1）皮下注射，共8周，建立大鼠肝纤维化模型，分别于第1、2、4、6、8周末各随机处死4只；剩余40只随机分为肝纤维化持续进展组(进展组)和肝纤维化自然逆转组(逆转组)，每组20只。进展组继续每周2次予50% CCl4油溶液皮下注射，剂量同前；逆转组停用CCl4，仅每周2次予纯花生油（3 ml·kg-1）皮下注射。两组分别于8周后第2、7、14、28天随机各处死5只，处死时拍照并肉眼观察肝脏形态。各组取相同肝叶固定于10%中性甲醛中，以便随后进行组织学检查，部分肝脏于液氮中速冻，-80 ℃冰箱内保存，用于制备匀浆检测RECK基因表达情况和MMP2活性。

　　1.2.2 肝脏病理形态学观察

　　将已固定的大鼠肝组织脱水、石蜡包埋、切片(厚度为4 μm)，作苏木精伊红(HE)染色。光镜观察，了解肝纤维化造模是否成功。

　　1.2.3 天狼猩红染色

　　大鼠肝组织切片脱蜡至水，浸0.1%天狼猩红苦味酸水溶液40 min，流水冲洗，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。利用Simple PCI图像分析软件，以红染部分占所取图像面积的百分比来判定肝纤维化程度。

　　1.2.4 MMP2活性检测(明胶酶谱法)

　　参照Carney等［5］的方法略加修改，用含1 mg·ml-1明胶(Sigma公司产品)的8% SDSPAGE浇制电泳板。肝组织蛋白提取液加等体积2×上样缓冲液混合并上样。电压80～120 V，至溴酚兰跑出胶底部前取出凝胶，割胶，漂洗，孵育，考马斯亮蓝R250染色，脱色，蓝色背景上的透亮带表示MMP2的活性，用SCIO IMAGE软件扫描，MMP2活性大小以条带面积×(MMP2的吸光度-底色的吸光度)表示。

　　1.2.5 RTPCR检测RECK mRNA的表达

　　PCR引物采用Lee等［6］所使用的引物，由上海英骏生物工程有限公司合成。上游引物为5′CCT AAC CTC TGC CCC AA3′，下游引物为5′ACG GGC CTC TGT AGG A3′，目的条带为214 bp。提取肝组织总RNA，并按照TaKaRa试剂盒的说明书进行逆转录和多聚酶链反应。PCR反应体系为5×PCR Buffer 5 μl，TaKaRa Ex Taq HS 0.15 μl，上游引物2 μl，下游引物2 μl，cDNA 4 μl，ddh3O 11.85 μl，总反应体系25 μl。反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃30 s，61.3 ℃ 30 s，共30个循环；72 ℃ 10 min。βactin作为内对照，上游引物为5′CCC TGG ACT TCG AGC AAG AGA T3′，下游引物为5′GTT TTC TGC GCA AGT TAG G3′。反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，共30个循环；72 ℃ 10 min。反应产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，用Smart view软件计算条带灰度值，RECK/βactin比值表示RECK mRNA表达水平。
　　
　　1.3 统计学处理
　　
　　采用SPSS 13.0软件作方差分析。实验数据用x-±s表示，组间比较用单因素方差分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

　　2 结果
　　
　　2.1 肝脏形态学
　　
　　肉眼所见：对照组大鼠肝脏颜色暗红，表面光滑，质脆柔软；纤维化组大鼠肝脏在实验早期呈暗红色或红黄相间，8周末肝脏体积缩小，表面粗糙有小结节，质地较韧；逆转组大鼠12周末肝脏颜色暗红，表面较光滑，质软；进展组大鼠12周末肝脏色淡，表面呈结节状，触之质韧。
　　
　　HE染色光镜观察：对照组肝小叶结构清晰，肝细胞可见轻度脂肪变性，无纤维结缔组织增生；纤维化组肝细胞出现广泛脂肪变性和水样变性及点状坏死，8周末可见肝小叶结构紊乱，伴不同程度的肝细胞脂肪变性，纤维组织大量增生，形成宽窄不一的纤维间隔；逆转组12周末时肝小叶结构清晰，肝细胞有少量脂肪变性，纤维间隔细、少；进展组12周末时纤维间隔宽，有假小叶形成，肝细胞脂肪变性明显(图1)。
　　
　　2.2 肝脏纤维化定性及定量分析
　　
　　天狼猩红染色显示，随造模成功周数的增加，大鼠肝组织胶原纤维沉积增多并逐步形成细小的纤维间隔，自然逆转时沉积逐渐减少，纤维间隔渐消失(图1)。图像分析显示随造模成功时间延长，肝纤维化面积比不断升高，8周之后，进展组肝纤维化程度继续升高，逆转组则逐渐下降(图2)。
　　
　　2.3 RECK基因的表达与MMP2活性变化
　　
　　在1～8周肝纤维化建模过程中，RECK基因的表达逐渐下降；在8周之后，进展组依旧下降，而逆转组呈上升趋势(图3)。在1～8周肝纤维化建模过程中，MMP2的活性逐渐上升；在8周之后，进展组依旧上升，逆转组呈下降趋势(图4)。RECK基因表达与MMP2活性具有相关性，在MMP2活性较强时，RECK基因的表达相对较弱；MMP2的活性较弱时，RECK基因表达相对较强。两者表达变化的总趋势相反，呈负相关(r=-0.900 13，P＜0.05)(图5)。
　　
　　3 讨论
　　
　　MMP2是ECM主要降解酶之一，其基因表达和活性调节是目前研究的热点，研究其表达调控机制有助于阐明肝纤维化发生的分子机制，从而找到疾病的发展规律，进而为防治肝纤维化提供新的靶点。多种因素参与MMP2的表达及活性调节，如基因、激素、生长因子、细胞因子、氧分压等。细胞释放的MMP2酶原必须活化才能发挥作用。已知MT1MMP与组织基质金属蛋白酶抑制因子2(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase2，TIMP2)在胞膜上联合作用后，再促进MMP2活化，且TIMP2是其特异抑制因子，现认为此乃该酶活性调节的主要途径［7-8］。然而，本组前期研究表明，肝纤维化过程中MMP2活性与TIMP2无明显相关性，提示尚有更重要的因素调节MMP2活性［9］。
　　
　　目前，在肿瘤方面RECK基因研究较多，它是一种基质金属蛋白酶抑制因子，在转录后水平抑制至少3种基质金属蛋白酶，即MMP2、MMP9及MT1MMP，具体表现为膜表面锚定的RECK基因抑制MMP9前体的分泌，而锚定的RECK蛋白及可溶性RECK蛋白均可抑制MMP2、MMP9及MT1MMP的活性。另外，RECK蛋白可通过抑制MT1MMP的活性，间接抑制MMP2前体蛋白向MMP2蛋白的转化过程。但是目前关于RECK基因的具体靶标及其调节机制尚不明了，RECK基因与组织金属蛋白酶抑制因子(TIMP)在一级结构上无明显的相似性，而在三维结构上是否具有相似性还有待研究［10-11］。
　　
　　本研究结果显示，随着肝纤维化的进展或逆转，大鼠肝组织内RECK基因表达和MMP2活性变化的总体趋势相反，出现此消彼长的现象，经统计学分析，发现两者存在相关性。在1～8周肝纤维化建模过程中MMP2的活性逐渐上升；在8周之后，进展组依旧上升，自然逆转组呈下降趋势，而同期的RECK表达基本呈负相关。由此我们推测，在肝纤维化进展及逆转过程中，RECK对于MMP2的活性起到一定的抑制作用。考虑到MMP2在肝纤维化早期能促进星状细胞活化，所以RECK表达可能抑制了肝纤维化发展。
　　
　　综上所述，本研究初步证实RECK基因与MMP2活性有一定的相关性，为进一步研究RECK基因对肝星状细胞MMP2表达及活性调节的机理提供了实验基础。但是RECK在蛋白水平的表达与M

参考文献

　　［1］TAKAHASHI C，SHENG Z，HORAN T P，et al.Regulation of matrix metalloproteinase9 and inhibition of tumor invasion by the membraneanchored glycoprotein RECK［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(22):1322113226.

　　［2］BATALLE R，BRENNER D A.Liver fibrosis［J］.J Clin Invest，2005，115(2):209218．

　　［3］BENNETT R G，DALTON S R，MAHAN K J，et al.Relaxin receptor in hepatic stellate cells and cirrhotic liver［J］.Biochem Pharmacol，2007，37(7):10331040．

　　［4］肖柳斌，刘国雄，邹丽宜.丹参防治小鼠肝纤维化性骨质疏松的作用研究［J］.中国西医结合">中西医结合外科杂志，2006，12(2):143144.

　　［5］CARNEY D E，MCCANN U G，SCHILLER H J，et al.Metalloproteinase inhibition prevents acute respiratory distress syndrome［J］.J Surg Res，2001，99(2):245252．

　　［6］LEE H，LIM C，LEE J，et al.TGFbeta signaling preserves RECK expression in activated pancreatic stellate cells［J］.J Cellular Biochem，2008，104(3):10651074．

　　［7］YANG C，ZEISBERG M，MOSTERMAN B，et al.Liver fibrosis：insights into migration of hepatic stellate cells in response to extracellular matrix and growth factors［J］.Gastroenterology，2003，124(1):147159．

　　［8］WINKLER M K，FOWLKES J L.Metallopoteinase and growth factor interactions：do they play a role in pulmonary fibrosis？［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2002，283(1):L111．

　　［9］陈平圣，翟为溶，张月娥.缺氧对肝星状细胞基质金属蛋白酶Ⅱ表达及活性调节的影响［J］.中华肝脏病杂志，2000，8（5）:276278.

　　［10］KURATA H，THANT A A，MATSUO S，et al.Constitutive activation of MAP kinases is critical and sufficient for the activation of MMP2［J］.Exp Cell Res，2000，254 (1):180188．

　　［11］WOOD M，FUDGE K，MOHLER J L，et al.In situ hybridization studies of metalloproteinases 2 and 9 and TMP1 and TMP2 expression in human prostate cancer［J］.Clin Exp Metastasis，1997，15(3):246258．