高浓度腺苷通过抑制细胞增殖促进细胞存活

【摘要】 目的: 研究危机环境下腺苷浓度增高对细胞的意义。方法:向细胞培养物中添加高浓度的腺苷来模拟危机环境，研究细胞对高浓度腺苷的生物学反应。结果:高浓度腺苷抑制细胞增殖，而不诱导细胞凋亡的发生;腺苷通过抑制细胞周期的进行而抑制细胞增殖;腺苷促进细胞在无糖环境下的存活。结论:腺苷通过抑制细胞增殖从而促进细胞在无糖环境下的存活。

【关键词】 腺苷;细胞生长;细胞周期;存活

　　[Abstract] Objective: To study the influence of increased concentration of adenosine on cells under environmental crisis. Methods: High concentration of adenosine was added to cell cultures to simulate environmental crisis， and the cell proliferation， cell cycle and survival of cells were examined. Results: Adenosine inhibited cell proliferation but did not induce cell apoptosis. Adenosine inhibited cell cycle and promoted cell survival under no glucose condition. Conclusion: High concentration of adenosine promotes cell survival by inhibiting cell proliferation.

　　[Key words] adenosine; cell proliferaton; cell cycle; survival

　　腺苷是细胞内的天然代谢产物之一。当细胞遭遇低氧低糖等环境生存压力时，细胞内外的腺苷浓度将急剧升高[1-3]。然而这种高浓度的腺苷对细胞产生的影响及其生物学意义鲜有报道。本研究通过向细胞培养物中添加高浓度的腺苷，模拟了低氧低糖环境下细胞内外腺苷浓度升高这一事件，同时检测这种高浓度下细胞的生长增殖、细胞周期、凋亡等事件，阐明危机情况下腺苷对细胞的影响，为进一步理解腺苷在机体细胞应对暂时性缺血等病理情况时发挥的作用提供理论基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 细胞培养及相关试剂

　　HEK293T细胞、MEF细胞均购自ATCC公司，置于含10%新生牛血清的DMEM培养基中，在37℃、体积分数为0.05的CO2 孵育箱中培养。RNase A、DMSO、MTT和PI购自Sigmaaldrich公司。

　　1.2 显微镜观察细胞密度

　　将对数生长期HEK293T细胞以(1～2)×104每孔接种于24孔板。置37 ℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中培养过夜后进行腺苷处理。腺苷处理前及处理24 h后分别在显微镜下拍照。

　　1.3 MTT法测细胞活力

　　在24孔板里按每孔(1～2)×104个细胞接种400 μl细胞悬液，置37 ℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中孵育过夜，进行药物处理24 h或48 h后;每孔加入40 μl MTT溶液(5 mg·ml-1)，37 ℃反应4 h;小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入100 μl二甲亚砜(DMSO)，室温孵育10 min;振荡后通过酶标仪测定各孔在570 nm的光吸收值，参比波长为690 nm，对每孔的光吸收值进行定量测定，每组设定3复孔。

　　1.4 PI 法测定细胞周期

　　胰酶消化细胞后，用含血清的培养基终止消化，离心收集细胞;然后用预冷的PBS洗涤细胞，弃上清，用100 μl PBS悬浮细胞;冷的体积分数为0.75的酒精1 ml滴加固定细胞(边振荡，边滴加);4 ℃固定过夜;2 000 r·min-1离心3 min;弃上清，PBS洗涤;2 000 r·min-1离心3 min;1×RNase(10～15 μg·ml-1)，消化15 min;PI染色10 min，利用流式细胞仪检测分析细胞周期。

　　1.5 细胞凋亡检测

　　收集细胞，PBS洗涤细胞，离心弃上清;用结合缓冲液洗涤细胞，离心弃上清，400 μl结合缓冲液悬浮细胞;加Annexin VEGFP，冰上避光20 min;每管加1 μl PI(500 μg·ml-1)，10 min后利用流式细胞仪检测细胞凋亡。

　　2 结 果

　　2.1 高浓度腺苷抑制细胞增殖但不诱导细胞凋亡

　　通过观察细胞密度可以看到，加入高浓度腺苷后，HEK293T细胞密度明显降低(图1A);MTT实验结果显示腺苷处理HEK293T细胞24或48 h后，HEK293T细胞活力随着腺苷浓度的上升逐渐降低(图1B);说明高浓度腺苷可以抑制细胞的增殖(图1B);流式细胞仪检测细胞凋亡显示高浓度腺苷处理细胞24 h并没有显著诱导细胞凋亡(图1C)。

　　2.2 高浓度腺苷通过抑制细胞周期从而抑制细胞增殖

　　细胞通过细胞周期而不断地自我增殖，我们利用流式细胞术检测腺苷是否通过抑制细胞周期的进行从而抑制细胞增殖。结果显示，高浓度腺苷明显改变HEK293T细胞周期的进程，导致G0/G1期和G2/M期细胞明显增多，呈阻滞现象(图2)。说明腺苷通过抑制细胞周期的进行从而抑制了细胞的增殖。腺苷可以通过细胞膜上的转运载体蛋白运输进入细胞质内发挥作用[4-5]，也可以通过与细胞膜受体结合发挥生物学功能[6-7]。我们通过向细胞培养物加入腺苷转运蛋白抑制剂发现，加入转运载体蛋白抑制剂缓解了腺苷对细胞的抑制作用，说明腺苷需要通过转运载体蛋白进入细胞内发挥其抑制细胞周期的作用(数据未公开)。

　　A. 腺苷抑制细胞增殖的细胞形态图; B. MTT法测定细胞活力(纵坐标为加药后的细胞活力占对照组细胞活力的比值); C. 用1 mmol·L-1腺苷处理HEK293T细胞24 h，无凋亡细胞图1 腺苷抑制细胞增殖

　　A. Cell morphology of HEK293T after adenosine treatment for 24 h; B. MTT assay of HEK293T after adenosine treatment(Y axis represents the ratio of proliferating activity of cells treated with adenosine to control group); C. Apoptosis of HEK293T after treatment with 1 mmol·L-1 concentration of adenosine

　　2.3 高浓度腺苷提高细胞在无糖环境中的存活率

　　在无糖条件下，细胞会大量分泌腺苷[2-3]，而腺苷可以抑制细胞周期的进行。因此，检验腺苷是否通过抑制细胞周期的进行从而提高细胞的存活率是十分有意义的。我们利用无糖培养基对MEF细胞进行连续培养32 h，结果显示(图3A)，3 mmol·L-1腺苷可以明显促进MEF细胞的存活;类似的在无糖条件下连续培养HEK293T细胞24 h，3 mmol·L-1腺苷可以明显减少细胞凋亡的发生(图3B、C)。

　　A. MEF细胞在无糖条件下连续培养32 h，对照组加DMSO，另一组加3 mmol·L-1 Adenosine处理; B. HEK293T细胞先用DMSO或Adenosine预处理4 h，然后换无糖培养基培养24 h; C. 图B中HEK293T细胞的凋亡分析结果

　　3 讨 论

　　低糖或无糖环境是细胞经常遭遇的危机环境，细胞怎样度过这种环境危机一直是研究的热点之一。在无糖条件下，细胞会大量分泌腺苷，关于这种分泌的高浓度腺苷对细胞的影响及其生物学意义鲜有报道，原因是腺苷在胞内外浓度的测定存在一定的困难，而且腺苷分子并不稳定，可以被细胞内的腺苷脱氨酶的脱氨作用代谢分解[1]。我们的研究发现，随着作用时间的延长，腺苷对细胞周期的抑制效果会有所下降。这种情况可能与腺苷分子的不稳定等因素有关。

　　我们的研究表明，细胞在无糖环境下分泌大量腺苷是细胞的一种自我保护机制。这种高浓度的腺苷通过抑制细胞周期的进行从而抑制细胞生长增殖，这种抑制作用降低细胞内的能量消耗从而提高了细胞的存活率。

　　总之，本研究揭示了腺苷通过抑制细胞周期的进行，有效地协助细胞度过遭遇的低糖生存危机，为临床上组织细胞在缺血环境下分泌大量腺苷的意义提供了一种生物学解释。

参考文献

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