脂质体纳米粒组装体作为药物载体的研究进展

　　　　 作者：吉顺莉， 李博， 李贞， 王成润， 金一， 戈延茹

【关键词】 脂质体纳米粒; 药物载体; 自组装; 表征; 应用

脂质体纳米粒 (Liposparticle)是一定浓度的脂质囊泡和纳米粒分散在水溶液中自组装形成的具有脂质外壳和纳米粒核心的新型组装体 (图1)，近来，在生物科技和药物、抗原、基因传递系统领域引起人们极大兴趣[1]。脂质体纳米粒具有以下特征[2]:①在温和的条件下自发形成;②粒径可控且结构稳定;③表面可以修饰;④载药量高，贮存时间长，给药前通过水化即可，防止药物的降解和损失;⑤包封的药物可以持续释放。脂质体纳米粒这种结构结合了纳米粒和脂质体的优点[3]，纳米粒核心可作为支撑骨架，赋予脂质层机械稳定性、可控的形态学、狭窄的粒径分布和最终材料的纯化。结合生物可降解的材料，粒子还可用于体内作为生物活性化合物的载体。而外周的脂质膜具有生物相容性，生物膜的拟生态行为(黏附，融合……)，在膜内或膜表面可与多种分子(脂溶性的或者水溶性的)相互作用，因此可作为不同生物分子的载体。生物载体治疗公司[4] 最先研究了一种基于交联的云芝多糖阳离子纳米粒(60 nm)外面包裹磷脂和胆固醇的混合物的系统，可用于疫苗和药物传递[5]。Rapuano等[6]对不同的支持物上的双分子层进行了研究，包括二氧化硅粒子、聚苯乙烯粒子和聚甲基异丁烯酸粒子，从吸附等温线、粒径、表面电荷、胶体稳定性和生物分子识别等几个方面研究了脂质包裹的纳米粒。近年来，国外对脂质体纳米粒及其载药制剂的研究越来越多，脂质体纳米粒自组装成的这种独特核壳结构也正成为制剂载药系统研究的热点之一，但国内研究报道较少。因此，本文通过查阅国内外相关文献，对脂质体纳米粒载药系统的最新研究进展进行综述。

　　1 脂质体纳米粒的构成材料及结构形式

　　脂质体是一种众所周知的制剂，已有广泛应用。当磷脂分散在水中时形成多层囊泡，并且每一层均为脂质双分子层。目前，脂质材料有中性脂质二棕榈酰胆碱(dipalmitoyl phosphatidylcholine， DPPC)、二硬脂酰胆碱(distearoyl phosphatidylcholine， DSPC)和二肉豆蔻酰磷酸酰胆碱(dimyristoyl phosphatidyl choline， DMPC);负电荷脂质有磷脂酸(phosphatidic acid， PA)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine， PS)和双鲸蜡磷酸酯(dicetaceumphosphate， DCP);正电荷脂质有N[1(2，3二油酰基)丙基]N， N， N三乙胺氯(N[1(2， 3dioleyloxy)propyl]N，N，Ntrimethylammonium chloride， DOTMA)、2，3二油酰基N[2(精氨酸基酰胺)乙基]N，N二甲基1丙基三氟乙酸胺(2，3dioleyloxyN[2(sperminecarboxyamido)ethyl]N，Ndimethyllpropanaminium trifluroacetate， DOSPA)、1，2二油酰氧丙基N，N，N三甲基溴化铵(1，2dipalmitoyl3trimethylammoniumpropane，DPTAP)等[7]。脂质体纳米粒的核心为不同粒径和性质的球形固体支持物。目前报道中，使用最多的无机物是二氧化硅粒子[8]。而在有机聚合物支持物的选择中，聚苯乙烯粒子使用得最多，是因为通过它比较容易得到粒度分布狭窄的胶体悬液[3，9]。此外还有一些研究使用的是生物环境下可完全降解的多糖核心，如糊精麦芽糖复合剂[10]和壳聚糖[11]，或生物可降解的脂肪族聚酯核心，如聚乳酸[12]。

　　脂质体纳米粒的形成是基于纳米粒与脂质膜之间的相互作用。将脂质囊泡与纳米粒溶液在一定温度下孵育，囊泡接触到纳米粒子以后产生融合作用，在纳米粒子的周围重组成连续的双分子层。Gilbert等[13]最先发明了“脂质呈递系统”，它将脂质吸附在所谓的玻璃微球表面上(直径≈1.6 μm)。为了检测脂质确实包裹着微球，在磷脂组成中掺入荧光探针[14]，通过荧光显微镜观察到粒子周围有均匀的荧光壳，表明脂质沉积在粒子表面，并且形成的脂质膜连续均匀。另外Bershteyn等[15]研究发现，包封纳米粒所用的脂质的量和组成不同也会导致最终的脂质体纳米粒系统外层形成多种脂质结构，如壳状、洋葱状或花瓣样。当脂质中掺入聚乙二醇化的脂质时，可以观察到花瓣状的脂质双分子层从聚合物核心向外延展[11](图2)，而不同结构粒子的细胞摄取率也相差很大。

　　a，b:二油酰磷脂胆碱(dioleoylphosphocholine， DOPC)脂质包裹的粒子时呈现“洋葱”状形态，多层脂质呈圆环状堆叠在粒子核心周围;c，d:当DOPC脂质掺入10%摩尔的聚乙二醇磷脂时，形成脂质“花朵”，“花瓣”从聚合物核心向外延展

　　图2 脂质的量和组成不同形成不同结构

　　2 脂质体纳米粒的制备

　　2.1 脂质体纳米粒的制备方法

　　脂质体纳米粒的制备，可以通过两种方法实现。第一种方法是直接将旋干的脂质膜与分散的纳米粒溶液水合(图3a)，但这种方法费时[16]，即使用相对合适的参数控制制备过程，还是不能控制最终的粒径及粒度分布。第二种方法是将事先制备好的囊泡与纳米粒溶液混合(图3b)，这种方法方便简单，易于控制粒径[17]。制备囊泡的不同方法有:①水合法;②水浴超声;③挤出法。而每种方法形成囊泡的粒径和均一性都不同，直接用旋干的脂质膜和用水合法形成的囊泡制备的脂质体纳米粒结果最差，而用挤出法制备的囊泡来制备的脂质体纳米粒最好。囊泡的粒径和粒度分布越小，越具有可控性和重复性。大的多层囊泡与小的单层囊泡相比，脂质在纳米粒表面的重组更加困难。

　　2.2 脂质体纳米粒制备的影响因素

　　2.2.1 连续相理化性质的影响 连续相的选择对脂质体纳米粒的制备至关重要。为了考察连续相对脂质体纳米粒制备的影响，Troutier等[3]以聚苯乙烯粒子为支持物模型，考察了缓冲液类型、离子强度和缓冲液pH值对不同电荷的囊泡与聚苯乙烯粒子构成脂质体纳米粒粒径的影响。结果表明，离子强度和pH值相同的不同种类的缓冲液对组装过程没有显著差异，说明脂质体纳米粒组装过程不受离子种类的影响。pH值的变化对脂质体纳米粒的组装过程也没有影响，因为DPPC在强酸至强碱范围内均为两性脂质，而DPTAP脂质的季铵基团使其对pH值变化不敏感。不同离子强度对阳离子和两性脂质囊泡的组装过程影响差异较大，对于阳离子脂质，高离子强度下制备使其电荷被屏蔽，容易聚集;而在低离子强度下制备好的脂质体纳米粒即使再置于高离子强度下也不发生聚集。这个现象说明囊泡和粒子之间的相互作用比制备好的脂质体纳米粒更容易受离子强度的影响。对于两性脂质，由于脂质体纳米粒的组装主要不是通过静电相互作用，因此离子强度的作用不突出。

　　2.2.2 脂质成分电荷的影响 脂质体纳米粒组装过程中，阳离子脂质成分百分比较低时粒径增大。Makino等[18]解释，DPPC头基可能显露了其阴离子部分而伸向外侧，由于DPPC/DPTAP的静电相互作用导致粒子聚集。随着DPTAP百分比的增加，静电斥力占优势，从而使组装体的粒径减小。在100%阳离子脂质成分的组装体中，多分散性很小，这表明脂质体纳米粒均为单个粒子，其粒径接近于空白粒子包裹着单个脂质双分子层。在100%两性脂质构成的脂质体纳米粒中，也未发生聚集，粒径和粒度分布都接近空白粒子，因为DPPC分子间缺少静电相互作用，从而避免了其聚集。

　　2.2.3 囊泡/粒子表面积比值的影响 影响脂质体纳米粒制备的另一个因素是最初的混合物中脂质囊泡与粒子的表面积比值，AV/AP(AV和AP分别是脂质囊泡和粒子的总表面积)，这个概念由CarmonaRibeiro等[19]最先提出。对于0 %，75 %，和100 %的DPTAP脂质组成，脂质体纳米粒的粒径和粒度分布不受AV/AP的影响，接近于空白粒子。而其他百分比(如10 %，25 %和50 %DPTAP)，随着AV/AP的增大，脂质体纳米粒的粒径逐渐减小。对于这部分比例的DPTAP，囊泡在AV/AP高时发挥静电稳定剂作用，而在AV/AP低时发挥促凝剂作用。AV/AP较低时发生聚集基于两种假设[3]:①在阳离子囊泡和阴离子粒子之间形成桥梁(局部“过剩”);②由于AV/AP较低，粒子没有完全被包裹，粒子的阴离子区域显露。而对于0% DPTAP，在所有范围的AV/AP比值中均不发生聚集。这也可用两种假想来解释:①阴离子粒子和略微负电荷的囊泡中没有形成桥;②在DPPC不完全覆盖的阴离子粒子间没有发生静电吸引。

　　3 脂质体纳米粒的表征

　　脂质体纳米粒组装体具有核壳结构，这种组装体可通过多种方法，从粒径、表面电荷、化学组成和形态等多个方面进行表征。

　　3.1 粒径和Zeta电位测量

　　粒径测定和Zeta电位测量可以说明脂质的有效吸附[20]。纳米粒表面被脂质膜包裹以后直观表现在粒径的略微增大。与带相反电荷的囊泡相互作用以后，纳米粒表面的电荷信号改变足以证明了聚苯乙烯纳米粒表面负电荷被阳离子脂质屏蔽。

　　3.2 X射线光电子光谱法(XPS)

　　XPS技术提供了一种新方法来表征包裹的脂质[3]。将DPPC脂质构成的脂质体纳米粒与空白聚苯乙烯纳米粒的XPS光谱相比，聚苯乙烯粒子的特征信号π→π*(292 eV处)消失，并且组装体表面的各种碳原子所占的百分比与DPPC的理论值接近，O/P(原子百分比)为7.6，接近DPPC的理论值8，从而证实粒子被脂质层所包裹。

　　3.3 显微镜技术

　　通过显微镜技术可得到组装体表面包裹的全部信息。为粒子和囊泡分别选择两种不同的荧光基团，若粒子的荧光信号与脂质信号重合说明粒子与脂质处于同一位置，粒子的荧光信号被脂质荧光信号覆盖进一步验证粒子被脂质所包裹。

　　3.4 超薄切片透射电子显微术(TEM)

　　将样品包埋于树脂中，可避免以往干燥过程中导致的目标物重排。包埋样品的切片通过TEM重点对粒子和染色脂质的电子云密度进行比较。将事先染色、包埋于树脂中的空白聚苯乙烯粒子和脂质体纳米粒进行超薄切片观察，与空白粒子相比，脂质体纳米粒影像显示粒子被一圈均一而深色的壳所包围，表明脂质层包裹着纳米粒。

　　3.5 差示扫描量热分析(DSC)

　　对包裹有两性脂质和阳离子脂质的纳米粒分别进行差示扫描量热分析。DSC结果显示都只出现了一个跃迁峰，这表明脂质形成了一个有序相，而不是以单分子吸附在支持物上而出现，这从一定程度上说明脂质包裹均一。

　　3.6 冻结蚀刻电子显微镜

　　这一技术允许在水合状态下观察样品，避免了传统方法造成的假象(样品干燥过程中结构变形)[21]。二氧化硅纳米粒的cryoTEM图像显示，由于粒子的微孔性出现了电子致密核。加入囊泡以后，脂质壳呈现出一个持续而均匀的双分子层，准确地出现在粒子轮廓上。

　　4 脂质体纳米粒作为药物载体的应用

　　4.1 药物靶向

　　纳米粒表面连接肿瘤坏死因子(TNF)后，可以作为有效的载体系统，激活TNF受体从而诱导细胞凋亡。但是由于潜在的全身毒性，体内应用受到阻碍。Messerschmidt等[22]将TNF纳米粒作为模型系统，在其外面包裹一层脂质膜，这样可以将TNF的活性暂时屏蔽，形成内部为单链TNF官能化的纳米粒;外层的脂质膜PEG化赋予其立体稳定性，并用单链抗体可变区基因片段(scFc)修饰，用于靶向有FAP(一种抗癌基因)标记的肿瘤间质。脂质包裹以后明显降低对FAP阴性细胞的细胞毒性，而对FAP阳性细胞的细胞毒性增加。通过脂质体包封，纳米粒装载生物活性分子，可以靶向特异性细胞。这种新型组装体除了安全性和靶向性，还适用于多种诊断和治疗，可将试剂包埋在纳米粒核心或分布于粒子表面，从而有利于靶向递药。

　　4.2 联合用药

　　肿瘤的多药耐药性需要细胞毒药物与化学敏感剂共同给药，而脂质体纳米粒系统可以同时包封多种药物。为了优化这种结合给药的效果，Wong等[23]将GG918特异的P糖蛋白抑制剂和多柔比星细胞毒药物这两种药物体外对耐药株乳腺癌细胞分别以溶液和脂质体纳米粒形式给药。结果表明，以脂质体纳米粒形式给药的治疗效果最显著，它能显著提高细胞对多柔比星的摄取与滞留时间。与溶液组相比，脂质体纳米粒组对肿瘤细胞的抑制作用增加了8倍。脂质体纳米粒系统提供了一种改善抗药肿瘤治疗效果的最佳、有效的途径。

　　4.3 作为基因治疗药物载体

　　脂质体纳米粒系统由于其有很好的生物相容性和体内稳定性，可以用作质粒 DNA和寡核苷酸的载体。Li等[24]研究了双十八烷基二甲基溴化铵(dioctadecyldimethylammoniumbromide， DODAB)脂质包裹的金纳米粒对哺乳动物细胞转染的介导作用。研究表明，DODAB脂质双分子层包裹金纳米粒以后，可以有效地将DNA质粒成功转染到HEK 293细胞中去。DODAB脂质包裹的金纳米粒的转染效率是DODAB脂质的5倍。脂质体纳米粒的出现为构造金纳米粒作为基因载体和纳米材料用于转染提供了一种新途径。

　　4.4 作为眼科药物载体

　　Diebold等[11]对脂质体壳聚糖纳米粒组装体(liposomechitosan nanoparticle complexes， LCSNP)作为眼科药物载体进行了研究。结果表明，LCSNP首先滞留在黏液层，然后不同程度地进入结膜细胞，并且其在体外未表现出细胞毒性，体内耐受性较好。总之，通过进一步研究，将来LCSNP可通过眼睛黏膜用于药物传送。

　　5 结语与展望

　　脂质体纳米粒系统作为给药载体具有突出的优势，它将脂质体与纳米粒的优点结合起来，具有很高的药物包封率、可调节的持续释放行为和良好的血清稳定性，可用于多种细胞和组织靶向。脂质体纳米粒组装体的核壳结构，使其内核可以作为疏水性药物的容器，外壳可对药物起保护作用，并且达到缓释作用。同时通过对脂质体纳米粒的表面修饰可以达到靶向作用。脂质体纳米粒这种非病毒载体没有免疫原性，不会引起细胞的免疫反应，将其包裹以后，可以保护基因类药物免受酶的降解到达细胞内，有望作为生物药物载体。相信随着研究的不断深入，脂质体纳米粒系统必将成为人类征服疾病的又一有力工具。

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