作者：王大军， 王琦， 王宁萍， 赵建宁， 黄菱， 徐涛
【摘要】 目的 研究鹅绒藤总生物碱(Cynanchum Chinense Total Alkaloid，CCTA)对正常小鼠体液免疫的影响。方法 给正常小鼠腹腔注射高(12.96mg/kg)、中(6.48mg/kg)、低(3.24mg/kg)3个剂量的CCTA，每天1次，连续7 d，于末次给药后12h，眼球取血并取脾脏，定量溶血分光光度试验进行小鼠脾脏抗体形成细胞检测，对小鼠血清溶血素进行测定。结果 CCTA高、中剂量组抗体形成细胞OD值及血清溶血素HC50明显高于免疫小鼠对照组(P＜0.05，P＜0.01)；与CCTA低剂量组比较，CCTA高、中剂量组抗体形成细胞OD值升高(P＜0.05)，血清溶血素HC50升高(P＜0.01)。结论 CCTA有提高正常小鼠体液免疫的作用。
【关键词】 鹅绒藤；生物碱；抗体形成细胞；小鼠
鹅绒藤(Cynanchum Chinense)为萝摩科鹅绒藤属(Cynanchum Chinense R.Br.)植物。野生于宁夏川区各地，资源极为丰富，夏、秋间随用随采。鹅绒藤味苦、性寒，具祛风解毒、健胃止痛之功效，全株具白色乳汁，民间常用鹅绒藤乳汁治疗寻常性疣赘，也有用于治疗耳乳突状瘤和甲癣的报道［1-2］。国内外现有研究表明，鹅绒藤水浸膏有明显的降压作用，其茎干乳汁冻干粉对蛙心和豚鼠离体心房表现明显的正性肌力(强心)作用，鹅绒藤全草水提物和氯仿提取物对实验小鼠有镇静催眠作用及中枢药理作用，而其正丁醇提取物可增强正常小鼠细胞免疫功能［3-6］。我们从鹅绒藤全草中提取了鹅绒藤总生物碱(Cynanchum Chinense Total Alkaloid，CCTA)，研究CCTA对正常小鼠体液免疫功能的影响，旨在对鹅绒藤的开发利用提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物 ICR小鼠，体重(20±2)g，雌雄各半，由宁夏医科大学实验动物中心提供，实验动物质量合格证编号为2007019，实验动物许可证号为SCXK(宁)2005-001。
1.2 仪器和药物 低温冷冻离心机(Beckman，美国)、VIS-7220N可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)、恒温水浴箱、100目不锈钢网、手术器械。RPMI-1640 培养基为美国Sigma 公司产品，CCTA由本校化学教研室指导提取并鉴定，鹅绒藤生药提取CCTA的得率为0.097‰。
1.3 方法
1.3.1 实验动物分组与给药 ICR小鼠(4～6周龄，体重20±2g，雌雄各半)50只，随机分为正常小鼠对照组，免疫小鼠对照组，CCTA高剂量(12.96mg/kg)组、中剂量(6.48mg/kg)组、低剂量(3.24mg/kg)组5组，每组10只。正常小鼠对照组和免疫小鼠对照组每天1次腹腔注射(ip)生理盐水0.2mL，CCTA高、中、低剂量组小鼠分别ip CCTA 12.96、6.48、3.24mg/kg，每日1次，连续7日。于给药的第3天除正常小鼠对照组以外的其余4组小鼠均一次性腹腔注射5%的绵羊红细胞(SRBC)0.2mL。第8天处死各组小鼠，体外测定各项指标。
1.3.2 小鼠血清和脾细胞悬液的制备 眼球取血，室温静置30min，2000 r/min离心10 min，吸取血清分装，-20℃保存。取血后颈椎脱臼法致死小鼠，剪开腹部各层，取出脾脏，剔除脂肪和结缔组织，放在尼纶网上，将尼纶网置于盛有Hank's液的平皿中，轻轻压挤脾组织，使单个核细胞经网进入平皿的Hank's液中，吸取平皿中的Hank's液于15mL离心管中，离心2000 r/min，5 min，弃上清。加入1mL三蒸水50s左右裂解红细胞，再用等量1.8% NS调至等渗，离心2000 r/min，5 min，弃上清。随后加Hank's液，离心2000 r/min，5 min，反复2次，去除血小板。最后将沉淀细胞用1 mL完全RPMI-1640培养液重悬，进行细胞计数，并且用2%台盼蓝检测活性细胞百分比(活细胞数大于95%)，调整脾细胞悬液浓度为5×106个/mL。
1.4 检测指标及方法
1.4.1 定量溶血分光光度法(QHS)［7］测定抗体形成细胞 在5mL的一次性离心管中加入1mL(5×106个/mL)的脾细胞悬液，0.2%SRBC悬液1mL，及1∶10的补体稀释液1mL，摇匀后置37℃水浴60min(孵育期间轻摇2次，避免细胞下沉)。取出后3000 r/min离心3min，取上清，分光光度计上波长413nm读吸光度(OD)值。
1.4.2 血清溶血素测定［8-9］ 小鼠血清做1∶50稀释。在5mL的一次性离心管中依次加入经1∶50稀释的小鼠血清1mL、5%SRBC 0.5mL、10%补体1mL，置37℃恒温水浴中孵育30min，然后移至冰浴中终止反应，1500rpm离心5min，取上清1mL，加都氏试剂3mL，摇匀放置10min，分光光度计于540nm波长比色读取OD值。另取5%SRBC 0.25mL，加入都氏试剂4mL，比色读取OD值，即为实验中所用SRBC半数溶血时的OD值。
血清溶血素含量以半数溶血值CH50表示，样品管中半数溶血值CH50按下式计算：
每只小鼠的血清CH50＝(样品的OD值/SRBC半数溶血时的OD值)×稀释倍数
1.5 统计学方法 运用SPSS 11.5软件进行实验数据分析，各组间采用方差分析进行两两比较。
2 结果
与免疫小鼠对照组比较，CCTA高、中剂量组抗体形成细胞OD值增高(P＜0.05，P＜0.01)，血清溶血素HC50也升高(P＜0.01)；与CCTA低剂量组比较，CCTA高、中剂量组抗体形成细胞OD值升高(P＜0.05)，血清溶血素HC50升高(P＜0.01)，见表1。表1 CCTA对小鼠抗体形成细胞和血清溶血素产生的影响▲ 与正常对照组比较**P＜0.01；与免疫对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与低剂量组比较，P＜0.05，▲P＜0.01
3 讨论
鹅绒藤主含甾体皂甙和生物碱，可能是其具有祛风解毒、健骨止痛功效以及外用治疗寻常性疣赘的主要成分。生物碱(alkaloid)是存在于植物中的碱性含氮化合物，往往是许多药用植物的有效成份，多具有明显的生物学活性，如免疫调节作用、抗肿瘤作用及抗菌抗病毒作用等［10］。
本研究发现CCTA高剂量组(12.96mg/kg)和中剂量组(6.48mg/kg)小鼠的抗体形成细胞OD值明显高于对照组(P＜0.01或P＜0.05)，同时高、中剂量组小鼠的血清溶血素半数溶血值CH50也明显高于对照组(P＜0.01)，提示高、中剂量的CCTA可促进正常小鼠脾脏抗体形成细胞的形成和血清溶血素的合成、分泌，且其促进脾脏抗体形成细胞形成与提高血清溶血素合成分泌的效果是一致的。抗体形成细胞和血清溶血素是代表机体体液免疫功能的可靠指标，因此，本研究提示，高、中剂量的CCTA可提高正常小鼠体液免疫水平。
现有研究发现许多中药或其活性成分对机体免疫功能呈双向调节作用，表现为小剂量(或低浓度)促进机体免疫功能，大剂量(或高浓度)抑制机体免疫功能。本实验结果可以看出，CCTA高、中剂量组之间的上述免疫学指标未见统计学意义(P＞0.05)，提示随着CCTA剂量的增加，其正向调节小鼠体液免疫功能的生物学活性不再增强，但是否会出现抑制作用，还要进一步实验以证实。曾有研究表明［6］，鹅绒藤全植株正丁醇提取物可增强正常小鼠细胞免疫功能，但其增强机体细胞免疫的活性成份与本实验中的增强体液免疫的活性成份是否相同，调节机制如何，还须进一步研究。
参考文献
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