【摘要】 目的观察11q23异常小儿急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞对肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体(TRAIL)所介导的细胞毒的敏感性，并探讨其机制。方法以11q23异常ALL细胞株3株及原代细胞为研究对象，通过测定细胞表面TRAIL受体表达、TRAIL作用后细胞的存活率及凋亡，观察11q23异常ALL对TRAIL的敏感性。结果除KOCL33对TRAIL部分敏感外，KOCL69、KOPB26及原代细胞对TRAIL高度耐受。原代细胞及3个细胞株DR4均呈阴性，DR5在KOCL33呈强阳性，而在其他细胞株呈阴性，原代细胞及3个细胞株均未表达DcR1及DcR2。结论11q23异常ALL细胞对TRAIL耐受的原因可能是细胞表面凋亡受体表达低下，并有可能是小儿11q23异常ALL迅速克隆扩增及GVL效应差的重要机制之一。
【关键词】 11q23;急性淋巴细胞白血病;凋亡诱导配体
40% ~70%的婴幼儿急性白血病(infant acute leukemia， IAL)存在11q23的染色体异常，包括易位、倒位、插入和缺失等，以t(4;11)(q21;q23) 为最常见[1-2]。11q23异常白血病大多恶性程度高，对化疗不敏感，完全缓解率(complete remission， CR)低，预后恶劣，且同种造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation， allo-SCT)无助于改善预后[3]。肿瘤的免疫监视受固有免疫和适应性细胞免疫调控，其中主要包括自然杀伤细胞(natural killer， NK)和细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte， CTL)[4-5]。研究表明，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor， TNF)相关的诱导凋亡配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand， TRAIL)在CTL和NK细胞介导的抗肿瘤免疫中起重要作用[6-9]。本研究中我们探讨了11q23异常急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞对重组人可溶性TRAIL(rhsTRAIL)的敏感性，研究结果如下。
1材料和方法
1.1研究对象
1.1.1细胞株及临床标本11q23异常ALL细胞株3株，其中KOCL 33为t(11;19)、具有FLT3-D835 突变[10];KOCL69为t(4;11);KOPB26为t(9;11)。Nalm1用作TRAIL敏感性对照，11q23异常ALL细胞株3株及幼仓鼠肾(BHK)细胞株来自日本山梨大学医学部小儿科。细胞株在37℃、5% CO2饱和湿度恒温培养箱条件下，培养于含10%FCS的RPMI-1640培养液中。取对数生长期细胞用于实验。1例患者[5月龄女孩，t(4;11)]的骨髓经Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离出单个核细胞(原始细胞&>95%)，RPMI1640 培养基离心洗涤，悬于加有10%FCS的RPMI-1640 培养基中。
1.2试剂及材料
rhsTRAIL(Killer TRAIL)购于Alexis公司，Caspase广谱抑制剂z-VAD-fmk、购于美国Sigma公司;Annexin-V-FITC购于BestBio(贝博，上海);DR4、DR5、DcR1及DcR2的单克隆抗体由顺天堂大学八木田秀雄先生惠赠。
1.3实验方法
1.3.13H标记的胸腺嘧啶腺苷渗入法将RPMI-1640完全培养液调制成2.0×105细胞·mL-1细胞悬液，接种于24孔板，每孔液体量为1 mL (最终浓度1×105细胞·mL-1)。对照孔加入新鲜培养液，TRAIL孔加入rhsTRAIL 100ng·L-1作用24 h，收集细胞，调制成1.0×106细胞·mL-1细胞悬液，接种于96孔平底培养板中，每孔100 μL(最终浓度0.5×105细胞·mL-1)，并做三个平行样。培养板按指定方法孵育36h，并在培养的最后6h内给予3H标记的胸腺嘧啶脉冲(每孔1μCi)，然后收集到玻璃纤维滤器上。用液体闪烁计数器计算整合入DNA的放射活性。通过添加或者不添加三倍稀释 (最终浓度11、33、100 ng·mL-1) rhsTRAIL 培养基中的42h孵育结果，确定rhsTRAIL的效果。分别加入rhsTRAIL中和性抗体RIK-2 (10μg·m-1)或z-VAD-fmk (20μM) LLnL (2.5μM)，阻断rhsTRAIL或caspases活性。rhsTRAIL的阻断率由以下公式算出：{1-[(处理孔的每分钟记数次数) /(未处理孔的每分钟记数次数)]} × 100。
1.3.2细胞存活率及和凋亡的检测将RPMI-1640完全培养液调制成2.0×105细胞·mL-1细胞悬液，接种于24孔板，每孔液体量为1mL(最终浓度1×105细胞·mL-1)。对照孔加入新鲜培养液，TRAIL孔加入rhsTRAIL 100ng·L-1作用24 h后收集细胞。a.台盼蓝拒染法确定细胞的存活率，并用以下公式计算细胞存活比率：(未添加rhsTRAIL培养基中的细胞存活比率)-(添加rhsTRAIL培养基中的细胞存活比率)。b.用FITC标记的Annexin-V染色，流式细胞仪(BD， FACSCalibur)检测早期凋亡。
1.3.2TRAIL受体在细胞表面的表达细胞株、临床标本以及幼仓鼠肾(BHK)细胞株(1×106个细胞)与1μg生物素标记的鼠IgG1或者单抗在冰上孵育30min，随后与藻红蛋白标记的抗生物素蛋白链菌素(上海亚培生物科技)冰上孵育30min，用流式细胞仪检测。相对荧光强度(RFI)为特异染色的平均荧光强度与对照染色的平均荧光强度之比。
2结果
2.1TRAIL对11q23异常 ALL细胞株的细胞毒作用
rhsTRAIL显著抑制Ph1阳性细胞Nalm1的生长。3株11q23异常ALL细胞中，KOCL33对TRAIL部分敏感，而KOCL69和 KOPB26对TRAIL高度耐受(图1a)。台盼蓝拒染试验结果与3H-胸腺嘧啶核苷渗入实验结果一致，KOCL33对TRAIL诱导的细胞毒中度敏感，而KOCL69和KOPB26不敏感(图1b)。图1aTRAIL对11q23异常ALL细胞株存活率图1bTRAIL对11q23异常ALL细胞株存活率的作用(3H标记的胸腺嘧啶腺苷渗入法)的作用(台盼蓝拒染试验)添加rhsTRAIL(100 ng·mL-1)培养12h后，KOCL33细胞中与Annxin-V结合的凋亡细胞百分率中度增加，而KOCL69和 KOPB26无明显变化(图 1c)。TRAIL的中和抗体RIK-2和广谱caspase抑制剂z-VAD-fmk都能完全阻断TRAIL的活性(图1d)，提示TRAIL对KOCL33的作用为caspase依存性及特异性。图1cTRAIL对11q23异常ALL细胞株早期凋亡的作用图1dTRAIL中和抗体对TRAIL活性的影响
2.211q23异常ALL细胞株TRAIL受体的表达用特异性单克隆抗体，经流式细胞仪分析细胞表面TRAIL受体DR4、DR5、DcR1、DcR2的表达。每个单抗均可特异性结合已转染不同人类TRAIL受体cDNA的BHK细胞系(图2a)。细胞株表面TRAIL受体的相对荧光强度如图2b所示，3株细胞DR4均呈阴性，DR5在KOCL33呈强阳性，而其它2个细胞株呈阴性。3个细胞株表面均未检测出DcR1及DcR2。 图2 aTRAIL受体单克隆抗体的特异性检测图2 b11q23异常ALL细胞株表面TRAIL受体的表达检测
2.3TRAIL对11q23异常ALL细胞的细胞毒作用
分离1例患者[5月龄女孩，t(4;11)]骨髓单个核细胞，流式细胞仪检测TRAIL受体在细胞表面的表达，添加TRAIL孵育12h后流式细胞仪检测Annexin V结合细胞率变化，孵育24h后台盼蓝拒染法检测细胞存活率变化。细胞表面DR4、DR5呈弱阳性，而DcR1、DcR2为阴性(图3a)。添加TRAIL后，活细胞减少率、Annexin V结合细胞率均无明显变化(图3b)。图3a11q23异常ALL原代细胞表面图3bTRAIL对11q23异常ALL原代细胞存活率TRAIL受体的表达检测及早期凋亡的影响
3讨论
恶性肿瘤细胞通常获得逃避机体免疫监视的能力以实现迅速克隆扩增[4]，免疫逃避机制与allo-SCT后移植物抗白血病(graft-versus-leukemia， GVL)效应失败有关[11]。因此，11q23异常白血病在发生过程中可能获得某种免疫逃避能力，导致allo-SCT后GVL效应失败。
TRAIL与其死亡受体DR4[12]及DR5[13]结合，诱导多种肿瘤细胞凋亡[9]，相反，TRAIL的其它两种细胞表面受体DcR1和DcR2缺乏死亡结构域活性，它们竞争DR4 和DR5与TRAIL的结合，称为“诱骗受体”。正常细胞选择性表达"诱骗受体"，因此TRAIL能选择性地诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无影响。
在动物模型中，TRAIL选择性作用于人类肿瘤移植物，而对正常组织无毒性，进一步证实了其作为抗癌药物的潜力[14]。在TRAIL缺陷的骨髓移植小鼠模型中，TRAIL为供体T细胞发挥移植物抗肿瘤(GVT)效应时所必须，但在移植物抗宿主病(graft-versus-host disease， GVHD)中几无作用[15]。
本研究的三株11q23异常ALL细胞中，除KOCL33对rhsTRAIL部分敏感外，其余对TRAIL显著耐受。3株细胞表面DR4均呈阴性，DR5在KOCL33呈强阳性，而其它2个细胞株均呈阴性，所有3个细胞株表面均未检出DcR1及 DcR2。原代细胞表面DR4、DR5也几乎无表达，DcR1、DcR2为阴性。这提示，11q23异常ALL细胞对TRAIL显著耐受，其主要原因可能是细胞表面DR4、DR5表达水平过低。KOCL33虽然DR5强阳性，诱骗受体阴性，但对rhsTRAIL仅为中度敏感，可能与KOCL33存在FLT3-D835突变有关。
研究表明，在all-SCT后CTL和NK细胞所介导的GVL效应中，TRAIL起着关键作用[9]。曾有报道，TRAIL能有效诱导Ph1-阳性ALL细胞凋亡，可能是Ph1-阳性ALL allo-SCT效果良好的关键因素之一[12]。11q23异常ALL细胞株对TRAIL普遍耐受，提示这些白血病细胞可能对GVL效应不敏感。由于TRAIL涉及固有免疫监视和适应性免疫监视[5，8]，TRAIL耐受有助于早期11q23异常ALL细胞逃离免疫攻击并进一步促进克隆扩增。
值得注意的是，11q23异常白血病细胞如何获得TRAIL耐受性，正常组织通常对TRAIL耐受，因为正常细胞选择性表达"诱骗受体"，所以TRAIL能选择性地诱导肿瘤细胞凋亡，对正常细胞无影响，而在肿瘤发生过程中，新生物通常获得对TRAIL的敏感性。据报道，在静止的CD34阳性造血祖细胞表面检测不到TRAIL的四种受体[16]，而11q23异常ALL起源于具有多重分化潜能的造血干细胞，提示11q23异常ALL细胞表现出造血干祖细胞的特点。更重要的是，近来有报道称，单核细胞在分化过程中，TRAIL的四种受体是可以诱导的[16]。11q23异常ALL细胞可能通过某种途径，逃避了白血病发生过程中DR4/DR5的上调或者诱骗受体的下调，从而导致细胞对TRAIL耐受，这给我们进一步研究提供了方向。
参考文献
[1]Biondi A， Cimino G， Pieters R， et al. Biological and therapeutic aspects of infant leukemia [J]. Blood， 2000， 96: 24-33.
[2]何亚香， 薛永权， 何军，等. 11q23异常儿童急性白血病的临床及实验室分析 [J].中华血液学杂志， 2003， 24(7): 358-361.
[3]Pui CH， Gaynon PS， Boyett JM， et al. Outcome of treatment in childhood acute lymphoblastic leukemia with rearrangements of the 11q23 chromosomal region [J]. Lancet， 2002，359(9321): 1909-1915.
[4]Reiman JM， Kmieciak M， Manjili MH， et al. Tumor immunoediting and immunosculpting pathways to cancer progression [J]. Semin Cancer Biol， 2007， 17(4): 275-287.
[5]Smyth MJ， Takeda K， Hayakawa Y， et al. Nature's TRAIL--on a path to cancer immunotherapy [J]. Immunity， 2003， 18: 1-6.
[6]Takeda K， Hayakawa Y， et al. Involvement of tumor necrosis factor-related apoptosis -inducing ligand in surveillance of tumor metastasis by liver natural killer cells [J]. Nat Med，2001，7: 94-100.
[7]Cretney E， Takeda K， Yagita H， et al. Increased susceptibility to tumor initiation and metastasis in TNF-related apoptosis-inducing ligand-deficient mice[J]. J Immunol， 2002， 168: 1356-1361.
[8]Takeda K， Smyth MJ， Cretney E， et al. Critical role for tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in immune surveillance against tumor development [J]. J Exp Med，2002， 195: 161-169.
[9]Schmaltz C， Alpdogan O， Kappel BJ， et al. T cells require TRAIL for optimal graft-versus-tumor activity[J]. Nat Med， 2002(8): 1433-1437.
[10]Taketani T， Taki T， Sugita K， et al. FLT3 mutations in the activation loop of tyrosinekinase domain are frequently found in infant ALL with MLL rearrangements and pediatric ALL with hyperdiploidy [J]. Blood ，2004， 103: 1085-1088.
[11]Kolb HJ， Schmid C， Barrett AJ， et al. Graft-versus-leukemia reactions in allogeneic chimeras [J]. Blood， 2003，103: 767-776.
[12]Pan G， O'Rourke K， Chinnaiyan AM， et al. The receptor for the cytotoxic ligand TRAIL [J].Science， 1997，276: 111-113.
[13]Pan G， Ni J， Wei YF， et al. An antagonist decoy receptor and death domain-containing receptor for TRAIL [J]. Science， 1997， 277:815-821.
[14]Walczak H， Miller RE， Ariail K， et al. Tumoricidal activity of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in vivo [J]. Nat Med，1999，5(2):157-163.
[15]姚悦萍，欧阳健.重组人可溶性TRAIL分子诱导白血病细胞株凋亡的研究[J].现代免疫学， 2006， 26(3): 234-238.
[16]Riccioni R， Pasquini L， Mariani G， et al. TRAIL decoy receptors mediate resistance of acute myeloid leukemia cells to TRAIL [J]. Haematologica， 2005， 90: 612-624.