TNFα在妊娠期糖尿病外周血单个核细胞和胎盘组织中的表达研究

【摘要】 　　目的 研究妊娠期糖尿病（GDM）孕妇血清中TNFα浓度与胰岛素抵抗的关系及TNFα mRNA在GDM孕妇外周血单个核细胞（PBMC）和胎盘组织中的表达状况。方法 用酶联免疫吸附（ELISA）法检测空腹血清中TNFα浓度，用Realtime RTPCR法检测PBMC和胎盘组织中TNFα mRNA的表达水平。结果 GDM组血清TNFα浓度明显高于正常糖耐量（NGT）组；在胎盘组织中，GDM组TNFα mRNA表达水平明显高于NGT组；在PBMC中，两组TNFα mRNA表达水平无明显变化。结论 血清TNFα浓度与胰岛素抵抗呈正相关，GDM组血清中升高的TNFα可能主要来源于胎盘组织，且参与了GDM 的发病过程。

【关键词】 妊娠期糖尿病 肿瘤坏死因子 胰岛素抵抗

　　【Abstract】Objective To study the relationship between the serum tumor necrosis factor alpha (TNFα) concentrations and insulin resistance;Then detect the expression levels of TNFα mRNA in peripheral blood mononuclear cells and placental tissue of patients with gestational diabetes mellitus(GDM).Methods Serum TNFα concentrations were measured by ELISA.The expression levels of TNFα mRNA in peripheral blood mononuclear cells and placental tissue of patients with GDM were determined by Realtime RTPCR. Results The concentrations of serum TNFα in GDM group are markedly higher than that in normal glucose tolerance(NGT) group. The expression levels of TNFα mRNA in placental tissue of GDM group were obviously higher than that in NGT group，while there were not significant difference in peripheral blood mononuclear cells of both group. Conclusion The concentrations of serum TNFα were positively correlated with insulin resistance， the increase in circulating TNFα of GDM group might originate from placental tissue and contribute to the pathogenesis of gestational diabeties mellitus.

　　【Key words】gestational diabetes mellitus；tumor necrosis factor；insulin resistance

　　妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）发病率呈逐年上升的趋势，严重危害了妊娠母婴的健康［1］。研究表明，孕妇体内胎盘激素和脂肪细胞因子（adipocytokines）的浓度改变所造成的胰岛素抵抗（IR）是引起GDM的主要原因，遗传因素在其中发挥了重要作用。肿瘤坏死因子α（TNFα）作为一种重要的脂肪细胞因子，目前已成为GDM发病机制研究的热点之一［2］。本文应用ELISA法和Realtime RTPCR法分别对晚孕GDM母体外周血中TNFα浓度、母体外周血单个核细胞(PBMC)和胎盘组织中TNFα mRNA的含量进行了检测和分析，以期为探讨TNFα与胰岛素抵抗的关系，及其在GDM发病中的作用提供实验依据。

　　资料和方法

　　1.研究对象

　　选取2008年4月至2009年1月在我院定期产检并住院分娩的孕妇，于孕24～28周行50 g糖筛查，服糖后1 h血糖≥7.8 mmol/ L者行75 g OGTT 试验，参照乐杰《妇产科学》第6版GDM诊断标准。随机选取28例GDM孕妇为病例组（GDM组），20例正常孕妇为对照组（正常糖耐量组，NGT组）。GDM组平均年龄29.31±2.32岁，平均孕周273.20±6.31天，平均体重指数（BMI）27.52±2.91 kg/m2；NGT组平均年龄29.27±1.85岁，平均孕周275.44±3.53天，平均体重指数（BMI）25.24±2.76 kg/m2。两组对象均排除全身急、慢性感染等已知能够导致TNFα升高的因素，年龄、孕周及体重指数（BMI）差异结果均无统计学意义(P＞0.05)。

　　2.仪器与试剂

　　主要仪器与试剂如下：ABI 7500 荧光PCR扩增仪、BACKMAN超速冷冻离心机、BIORAD 680酶标仪、淋巴细胞分离液Ficoll(上海华康生物技术发展中心)、TRIZOL mRNA提取试剂盒（INVITROGN公司）、TRKARA RTPCR 试剂盒（宝生物工程（大连）公司）、TNFα ELISA试剂盒（晶美生物工程有限公司）。

　　3.ELISA法测定血清中TNFα浓度

　　所有研究对象空腹8～12 h后，于次日晨抽取肘静脉血3 ml，1 h内分离血清，置-20℃保存，取0.5 ml用于ELISA法检测TNFα浓度，剩余血清用于测定FBG、FINS等相关生化指标。

　　4.Realtime RTPCR检测TNFα mRNA

　　①PBMC的分离：静脉血5 ml肝素抗凝，加入淋巴细胞分离液，2000 rpm离心20 min，吸取单个核细胞层，PBS液洗涤，取细胞沉淀置-80℃备用。②胎盘的采集：胎盘娩出后，立即无菌取母体面中央约1.0×1.0×1.0 cm3的胎盘组织（避开梗塞及钙化灶），冰生理盐水冲洗，吸去水份，分别用锡箔纸包好标记，立即置于液氮罐中10～15min，取出置-80℃冰箱备用。③Realtime RTPCR：操作按说明书进行，用TRIZOL法提取PBMC及胎盘组织中总mRNA（GDM组10例，NGT组7例），取1μl总mRNA为模板，逆转录合成cDNA第一链，取1 μl合成的cDNA产物为模板，用于Realtime PCR扩增(SYBR Green I嵌合荧光法)，以βactin基因为内对照，扩增引物参照文献［3，4］序列设计，由上海生工生物工程有限公司合成，序列如下。TNFα（180bp）：正向5’TTGGGATCATTGCCCTGTG3’；反向5’CGAAGTGGTGGTCTTGTTGCT3’。βactin（190bp）：正向5’TCCTAGCACCATGAAGATC3’；反向5’AAACGCAGCTCAGTAACAG3’。PCR反应体系如下：5×PCR Buffer 10 μl、TaKaRa Ex Taq HS 1.25 μl、引物各0.5 μl、cDNA模板2 μl、加DEPC水至40 μl。反应条件如下：94℃预变性2 min（94℃变性10 Sec、59℃退火10 Sec、72℃延伸30 Sec，40 Cycles，于72℃收集荧光信号）。用2⊿⊿CT法对TNFα mRNA进行相对定量。

　　5.统计学处理

　　实验数据均以 -±s表示，比较两组计量资料的组间差异用ANOVA方差分析，相关关系用直线相关分析，统计软件用SPSS 13.0，P＞0. 05有统计学意义。

　　结 果　　

　　1.血清生化指标及TNFα检测结果

　　两组对象血清生化指标及血清TNFα检测结果见表1，GDM组空腹血糖（FBG）、空腹血清胰岛素（FINS）、胰岛素抵抗指数和血清TNFα浓度均高于NGT组，结果差异均有统计学意义（P＜0.01）。TNFα浓度与胰岛素抵抗指数（HOMAIR= ( FINS ×FBG)/22.5）直线相关分析结果表明，TNFα与HOMAIR呈正相关(r=0.41，P＜0.05)。
表1 两组对象血清生化指标及TNFα结果比较（略）

　　2.TNFα mRNA RTPCR结果

　　如图1～6所示，在PBMC中，GDM和NGT组的TNFα mRNA表达水平无明变化，Realtime PCR扩增的CT均值分别为36.84、36.39，⊿CT=0.45，结果差异无统计学意义（P＞0.05）。在胎盘组织中，GDM组的TNFα mRNA表达水平明显高于NGT组，Realtime PCR扩增的CT均值分别为32.46、35.69，⊿CT=-3.23，结果差异有统计学意义（P＜0.05）。Realtime PCR熔解曲线分析结果证实，两组TNFα mRNA的PCR扩增均为特异性扩增，其熔解曲线为单峰曲线。用2⊿⊿CT法计算，GDM组TNFα mRNA的相对含量是NGT组的9.38倍。

　　讨 论　　

　　妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是指妊娠前无糖尿病和糖耐量异常，在妊娠期发生或首次发现的糖尿病或糖耐量异常。近年来，国内外研究显示GDM的患病率明显增加，呈逐年上升的趋势。若不采取有力的干预和监护，许多GDM患者将会转变为2型糖尿病（T2DM）［1］。此外，GDM会对产妇及胎儿产生不良影响，易引起产妇酮症酸中毒、妊娠高血压疾病、胎膜早破、早产等，GDM患者的新生儿发生新生儿低血糖症、新生儿窒息、新生儿红细胞增多症、新生儿黄疸等的危险性也明显增加［5］。

　　GDM的病因及发病机理尚未十分明确，孕期胎盘激素水平的升高和脂肪细胞因子的作用所造成的胰岛素抵抗（IR）是其主要原因［6］。妊娠期胎盘分泌的具有分解脂肪作用的激素增多，从而致血清游离脂肪酸、TNFα、Fbg、CRP 等炎症因子的增加与妊娠期IR密切相关。研究表明，TNFα是妊娠过程中产生IR的中心环节［2］，TNFα通过干扰胰岛素的生物信号来抑制其生物学作用，其可能机制如下［7～9］：①抑制脂肪、肌肉细胞膜上的葡萄糖转运蛋白，使其表达减少、功能减退。②通过影响脂肪细胞、肝细胞上胰岛素受体的数量及其与胰岛素的亲和力，下调胰岛素受体信号，从而导致胰岛素敏感性下降。③通过激活鞘磷脂酶及神经酰胺类物质，以干预胰岛素受体自身磷酸化，最终导致IR。此外，TNFα与其它可导致胰岛素抵抗的激素的相互作用也是导致IR的重要原因，譬如TNFα可阻碍脂联素在脂肪细胞中表达，而脂联素可减弱脂肪细胞中TNFα的信号传导并防止IR的进展［10］。本研究结果证实，GDM孕妇外周血中TNFα浓度明显高于NGT对照组孕妇，且其升高程度与HOMAIR呈正相关，从而提示TNFα参与了妊娠期糖尿病的IR，是GDM的重要致病因素之一。

　　TNFα主要由单核巨噬细胞产生，此外，子宫内膜、胎盘、卵巢、输卵管、脂肪组织中均有TNFα表达［11，12］。在妊娠期，胎盘组织是TNFα的主要来源，体外实验［2］发现胎盘产生TNFα 的速度约为123.1±51.6 pg·min-1·g-1，其中约(94±3)%释放到母体循环，(6±3)%释放到胎儿循环。分娩后随着胎盘离体，母体中循环TNFα水平急剧下降，这可能是分娩后IR逆转的原因之一。本研究利用Realtime PCR技术检测GDM孕妇PBMC和胎盘组织中TNFα mRNA的表达情况，发现TNFα mRNA在GDM孕妇胎盘组织中表达水平为NGT组的9.38倍，但在PBMC中两组表达水平结果差异无统计学意义，从而提示GDM组孕妇血清中升高的TNFα主要来源于胎盘组织。TNFα升高的原因及作用机制尚待进一步研究，但TNFα的升高可能与高血糖在一定范围内相互形成恶性循环，从而参与了GDM的发病过程。

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