结肠癌裸鼠移植瘤中Raf1的表达与肿瘤血管生成的相关性

【摘要】 目的: 研究Raf1在结肠癌裸鼠移植瘤中的表达与肿瘤血管生成的关系。方法: 通过Western blot方法检测不同结肠癌细胞系（HT29、 SW480、 LS174T）中Raf1的表达， 然后将表达差异较大的2株细胞（HT29、 LS174T）分别接种到BALB/c nu/nu小鼠体内， 分别观察肿瘤的生长速度、 瘤重变化等情况， 最后通过免疫组化的方法分别检测瘤组织中Raf1的表达及肿瘤微血管密度（MVD）的情况， 分析二者的相关性。结果: 在裸鼠移植瘤模型中， LS174T组移植瘤生长速度及瘤重大于HT29组; 免疫组化结果显示Raf1在LS174T组中的强阳性率为50％， 在HT29组中为10％， 两组之间的差异有统计学意义（P&<0.01）; 在LS174T组中MVD平均值为28.32±5.2， HT29组MVD平均值为19.23±4.7， 两组之间MVD值差异有统计学意义（P&<0.01）。结论: Raf1是调控肿瘤组织血管生成的关键分子， 在结肠癌裸鼠移植瘤中Raf1的表达与MVD值成正相关。

【关键词】 Raf1 肿瘤血管生成 裸鼠 微血管密度 结肠癌

　　结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤，恶性程度较高， 是目前危害人类健康的重大恶疾之一。众所周知， 肿瘤的生长、 浸润、 转移依赖于肿瘤内新生血管的形成， 新生血管不仅为肿瘤组织提供足够的营养和氧， 还提供大量的生长因子， 促进肿瘤迅速生长。然而， 血管生成是一个复
杂的过程， 有诸多分子共同参与。研究表明， Raf1可能是调控肿瘤血管生成的一个关键分子， 在内皮细胞生存和血管生成过程中发挥重要的调节作用［1］。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　人结肠癌细胞株HT29、 SW480、 LS174T由第四军医大学生物化学实验室和西京医院消化科实验室提供。雌性BALB/c nu/nu小鼠（20 只， 体质量17～20 g， 鼠龄4～5周）购自中国科学院上海实验动物中心［许可证号: SCXK(沪) 2004 0011］， 在第四军医大学实验动物
中心SPF 级实验室饲养。Western blot及免疫组化所用基础试剂均来自第四军医大学生物化学实验室， Raf1单克隆抗体（mAb）购自Signal Antibody Technology， SAT公司。CD34mAb购自Cell Signaling公司。生物素HistostainTMPlus Kits免疫组化染色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养

　　人结肠癌细胞株HT29、 LS174T采用含100 mL/L小牛血清RPMI1640培养， SW480 采用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基培养， 在37℃、 50 mL/L CO2培养箱内培养， 取生长状态良好的对数生长期的细胞用于实验。

　　1.2.2 Western blot测不同结肠癌细胞系中Raf1的表达

　　取对数生长期肿瘤细胞加入RIPA裂解液裂解细胞， 提取总蛋白， BCA法测定蛋白浓度。每种样品以40 μg总蛋白上样， 进行100 g/L SDSPAGE 凝胶电泳，恒压120 V， 60 min。电泳结束后，取下凝胶， 100 V电转移2 h， 使蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC) 膜上。将NC膜用15 g/L BSA室温封闭2 h。加入一抗(兔抗人Raf1mAb， 1∶200)， 4℃摇床孵育过夜。加入二抗（鼠抗兔IgG/HRP， 1∶3 000）室温孵育1 h。将NC膜置于ECL(增强化学发光试剂) 中反应1～3 min ，暗室中使X线片曝光，常规方法显影定影。X线片上的条带用图像分析系统进行分析，测定积分灰度值，将Raf1/βactin 的比值作为蛋白表达的相对量［2］。

　　1.2.3 裸鼠移植瘤模型的建立

　　将对数生长期的结肠癌细胞消化浓缩至2×1010/L，于无菌条件下给每只裸鼠背部皮下注射， 穿刺点距注射部位
1.2 cm， 每只裸鼠皮下接种1点， 每点0.2 mL， 细胞密度为4×109/L。逐日观察肿瘤生长情况。肿瘤细胞接种后3 周， 各鼠称重， 测量瘤体大小，按下列公式计算肿瘤体积:V=abc， abc 分别代表肿瘤的长、 宽、 高(mm)， 均值经t检验［3］。

　　1.2.4 Raf1及CD34免疫组织化学染色

　　裸鼠处死后， 将肿瘤剥离， 标本用40 g/L甲醛固定， 石蜡包埋， 切片（约4 μm）; 石蜡切片常规二
甲苯脱蜡， 梯度乙醇至水， 30 mL/L h3O2阻断内源性过氧化物酶10 min， HistostainTMPlus试剂A（山羊血清封闭液）室温孵育10～15 min， 加一抗（Raf1mAb 1∶50）4℃孵育过夜， HistostainTMPlus试剂B(生物素化二抗)室温孵育10～15 min ， HistostainTM Plus试剂C（辣根过氧化物酶标记的三抗）室温孵育10～15 min， 以上各步骤间均以PBS冲洗3次， DAB显色， 苏木精复染， 梯度乙醇脱水， 二甲苯透明， 中性树胶封片。另用PBS代替一抗作阴性对照。CD34染色过程同Raf1。

　　1.2.5 免疫组织化学染色结果判定

　　Raf1染色的阳性信号为胞质内的棕黄色颗粒。取表达最强的部位， 按着色程度计分: 无着色者为0分;
浅黄色、 略高于背景者为1分; 棕黄色、 明显高于背景者为2分; 强染、 着棕褐色者为3分。同时按染色阳性细胞的百分比计分: &<5%为0分; 6％～25％为1分; 26％～50％为2分; 51％～75％为3分; &>75％为4分。两项计分相加后分为4个等级: 0～1分为阴性（-）， 2分为弱阳性（＋）， 3～4分为中等阳性（）， 5分以上为强阳性（）。CD34免疫组化染色阳性显示为新生微血管密度（MVD）， 其判定方法: CD34染色的组织标本中观察到由内皮细胞或幼稚内皮细胞形成的管状、 窄隙状、 囊状和空泡状染为黄褐色的结构即判定为可计数的微血管， 400倍光镜下计数全部横切和纵切的微血管数作为MVD计数。

　　1.2.6 统计学处理

　　采用SPSS11.0软件， 对Raf1与MVD的结果之间的比较分别采用了χ2检验、 t检验、 Pearson积差相关以及秩和检验等方法。

　　2 结果

　　2.1 Western blot检测HT29、 SW480、 LS174T中Raf1的表达

　　Western blot分析结果显示， 3株细胞都在相对分子质量（Mr）约74 000的位置出现了特异性条带， 而且用肉眼很容易发现LS174T中Raf1的表达量明显高于HT29、 SW480， 经分析后显示HT29表达量最低（图1）。
因此， 选择LS174T和HT29接种至裸鼠， 分析Raf1和肿瘤血管生成的关系。
　　
　　2.2 荷瘤裸鼠肿瘤体积增长曲线

　　实验过程中检测瘤体积变化， 绘制移植瘤生长曲线。随着时间的延长， 移植瘤逐渐增大， 但HT29组与
LS174T组比较(n=10)， 其肿瘤生长速度显著减慢(图2)。实验结束时， HT29组平均瘤体积为(0.38±0.01)cm3、 平均瘤重为(1.31±0.17) g， 明显小于LS174T组的平均瘤体积(0.72±0.03)cm3、 平均瘤重(2.02±0.32) g， 经t检验有统计学意义(P&<0.05)。实验结果提示LS174T的侵袭
性及恶性程度明显高于HT29。

　　2.3 移植瘤组织中Raf1的表达及新生血管形成情况

　　Raf1阳性染色位于胞质内， 多为弥漫阳性， LS174T组的染色强度明显高于HT29组（图3A、 B）。Raf1在LS174T组中的强阳性率为50％， HT29组为10％， 两组之间的差异有统计学意义（P&<0.01）。两组移植瘤组织中Raf1的表达和比较见表1。CD34为内皮细胞表面的特异性分子， 因此CD34染色位于内皮细胞表面， 为弥漫阳性， 表现为杂乱无章的不规则的微血管网， LS174T组数目较HT29组多(图3C、 D）。两组移植瘤组织的MVD值及具体比较见表1， 经t检验二者有统计学意义（P&<0.01）。

　　2.4 移植瘤组织中Raf1的表达与MVD的关系

　　Raf1表达阳性率高的LS174T移植瘤组织MVD值亦较高， Raf1表达阳性率低的HT29移植瘤组织MVD值亦较低。在10例LS174T移植瘤标本中Raf1表达强阳性的为5例， MVD平均值为（32.72±4.6）， 中等阳性的为3例， MVD平均值为（27.51±4.3）， 弱阳性的为2例， MVD平均值为（23.81±4.1）; 在10例HT29移植瘤标本中Raf1表达强阳性的为1例， MVD值为（25.0±3.0）， 中等阳性的为5例， MVD平均值为（20.7±4.3）， 弱阳性的为4例， MVD平均值为（17.3±4.5）， 经χ2检验2组移植瘤组织中Raf1的表达差异有统计学意义（P&<0.01）。HT29组（n=10）中MVD平均值为（28.32±5.2）， LS174T组（n=10）中MVD平均值为（19.23±4.7）， 经t检验
2组移植瘤组织中CD34的表达差异有统计学意义（P&<0.01）， 经Pearson积差相关检验， Raf1表达和MVD值呈明显正相关（P&<0.01）。表1 移植瘤组织中Raf1的表达与MVD值（略）

　　3 讨论

　　血管生成是指原始血管网生长、 重组形成成熟血管网的过程， 包括形成血管、 扩增及分枝， 它是肿瘤生长、 侵袭、 转移、 和复发的基础。肿瘤血管生成是指肿瘤细胞诱发的毛细血管新生以及肿瘤中毛细血管网的形成［4］。用CD34免疫组化法检测肿瘤组织中MVD的情况， 可以观察到新生微血管呈弥散性分布， 在临床工作中， 此技术已用于判断乳腺、 结直肠、 卵巢、 肝脏、 前列腺和膀胱等肿瘤的预后， 如结合计算机图像处理计算微血管的面积， 对预测肿瘤的预后更有客观性［5］。

　　结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一， 发病率和病死率均较高。目前已知肿瘤血管生成是肿瘤生态系统中的一个重要因素， 参与和影响肿瘤的生物学行为［6］。在肿瘤血管形成过程中， 有诸多促血管生成因子参与了此过程， 其中癌基因Raf1可能是调节肿瘤血管生成的一个关键
分子。如果控制了这诸多分子信号转导过程中的某个关键环节， 那么这些分子的促血管生成作用即被阻断。

　　Raf1是一种丝/苏氨酸蛋白激酶， 参与有丝分裂信号从细胞膜到核的转导， 功能活跃，它不但在细胞增殖信号途径中发挥着重要的作用， 而且在其他多种细胞信号转导途径的相互作用中亦起着交联点的作用［7］， 参与肿瘤发生、 多药耐药、 细胞周期调控及凋亡， 同时刺激血管内皮细胞增殖及抗凋亡， 在肿瘤新生血管生成中发挥重要作用。一方面， Raf1通过调节血管生成相关分子的表达水平， 最终刺激血管生成［8］; 另一方面， 在VEGF和bFGF诱导的血管内皮细胞抗凋亡信号转导中， Raf1也是一个重要的节点分子， Raf1功能丧失可直接诱导血管内皮细胞抗凋亡信号转导［9］。Mukhopadhyay等［10］在缺氧诱导血管生成的研究中， 发现负显性的Raf1可明显抑制缺氧诱导的VEGF的表达。还有研究显示，将Raf1 siRNA转入内皮细胞后可明显抑制内皮细胞的增殖生长［11］。此外， 国外还有研究表明:一种名为BAY 439006的raf激酶抑制剂可以拮抗多种酪氨酸激酶的受体， 如: VEGFR2、 VEGFR3、 PDGFRβ、 Flt3、 cKit、 p38α［12］。这些均说明Raf1是调控肿瘤血管生成的一个关键分子。

　　本实验通过Western blot方法检测不同结肠癌细胞株中Raf1的表达， 从而选取2株表达差异较明显的细胞， 建立裸鼠移植瘤模型。通过观察2组裸鼠移植肿瘤的生长情况， 我们发现Raf1表达较高的LS174T组裸鼠移植瘤的生长速度以及肿瘤重量均大于Raf1表达较低的HT29组。

　　由此我们可以看出， Raf1的表达可能与肿瘤的生长和侵袭性有一定的关系。裸鼠处死后， 从肿瘤组织标本免疫组化的分析结果来看， LS174T组Raf1及MVD的表达水平均高于HT29组， 经统计学分析后发现结肠癌裸鼠移植瘤中Raf1的表达与MVD的表达水平呈明显正相关。Raf1可能是调节肿瘤血管生成过程中的一个关键的节点分子， 是MVD高水平表达的上游因素。该研究为Raf1相关分子的生物学治疗奠定一定的实验学基础，并有可能开辟出抗肿瘤血管生成基因治疗的一条新途径［13］。

参考文献

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