丹酚酸B作用不同时间对高糖高脂内皮细胞凋亡的抑制作用

　　　　　　 作者：鲍丽颖 范英昌 郑纺 张洁

【摘要】 目的 观察丹酚酸B抑制高糖高脂诱导的内皮细胞凋亡的作用。方法 以糖基化终末产物(AGEs)和氧化低密度脂蛋白(oxLDL)联合作用诱导人脐静脉内皮细胞凋亡，通过Hochest33258染色，观察并比较丹酚酸B及洛伐他汀作用不同时间(12、24、36、48、72 h)，抑制高糖高脂诱导的内皮细胞凋亡的效果。结果 研究表明，洛伐他汀作用12、24 h时，抑制内皮细胞凋亡效果明显，而丹酚酸B作用36、48 h及72 h抑制内皮细胞凋亡效果显著。结论 与洛伐他汀相比，丹酚酸B抑制高糖高脂诱导的内皮细胞凋亡的作用发挥得较迟缓，但效果持久。

【关键词】 丹酚酸B;糖基化终末产物;氧化低密度脂蛋白;内皮细胞凋亡

　　【Abstract】 Objective To compare the effects of salvianolic acid B and lovastatin inhibiting endothelial cells apoptosis after incubation for different time.Methods Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) apoptosis were induced by AGEs and oxLDL. After HUVECs were incubated salvianolic acid B and lovastatin for 12， 24， 36， 48， 72 h， percentage of apoptosis were observed under fluorescent microscope by Hochest 33258 staining. Results Although treatment with lovastatin for 12， 24 h， apoptosis decreased significantly (P&<0.05)， treatment with salvianolic acid B for 36， 48 and 72 h， apoptosis decreased significantly (P&<0.05). Conclusions Compared with lovastatin， salvianolic acid B might exert a later but lasting inhibition effect on endothelial cell apoptosis induced by highsugar and highfat.

　　【Key words】 Salvianolic acid B; Endothelial cells apoptosis

　　研究发现糖尿病(DM)患者血管并发症的产生与糖代谢和脂质代谢异常密切相关〔1〕。当机体长期处于高血糖状态时，导致糖基化终末产物(AGEs)的产生多于清除，造成其在体内积聚，损伤血管内皮，可能是DM动脉粥样硬化的始动因素之一。本实验中采用AGEs联合氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导内皮细胞凋亡，建立细胞模型，以洛伐他汀为阳性对照，选取不同作用时间，观察丹酚酸B对内皮细胞的保护作用，进一步探讨DM致动脉粥样硬化的机制及寻找有效药物，为防治DM血管并发症提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 药物、试剂与仪器 丹酚酸B(天津天士力现代中药资源有限公司，批号20060601);洛伐他汀胶囊(扬子江药业，国药准字H12980272);人脐静脉内皮细胞(ECV304细胞株)购自天津血液研究所;oxLDL购自中国医学科学院研究所;AGEs、 RPMI1640培养基、0.25%胰酶购自Gibco公司;新生胎牛血清购自HyClone公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司; 超净工作台、CO2恒温培养箱、倒置相差显微镜、荧光显微镜。

　　1.2 MTT比色法确定AGEs、oxLDL丹酚酸B及洛伐他汀处理内皮细胞的最佳浓度 取对数生长期细胞制成1×105/ml的细胞悬液，接种于96孔培养板内，每孔100 μl，设6个复孔，换无血清培养液同步化24 h后加入不同浓度的AGEs，对照孔及调零孔加100 μl培养液，继续培养24 h，于结束前4 h每孔吸去上清液，加100 μl MTT(浓度为0.5 mg/ml)继续培养4 h，调零组不加MTT，吸去全部上清，然后每孔加200 μl DMSO，震荡摇匀，于酶联免疫检测仪上测每孔吸光度(检测波长570 nm)，按下列公式计算抑制率(IR)：IR=(1-实验组吸光度值/对照组平均吸光度值)×100%。oxLDL、丹酚酸B及洛伐他汀处理内皮细胞的最佳浓度方法同上。

　　1.3 分组 1×105个/ml接种细胞于24孔培养板中，置于37℃、5% CO2培养箱内培养。换无血清培养液同步化24 h，随机分为：①正常对照组;②模型组：加入终浓度为100 μg/ml的AGEs和终浓度为10 μg/ml的oxLDL;③洛伐他汀组：加入终浓度为50 μmol/L的洛伐他汀预处理2 h后，加入终浓度为100 μg/ml的AGEs和50 μg/ml的oxLDL; ④丹酚酸B组：加入终浓度为2×10-4mol/L的丹酚酸B预处理2 h后，加入终浓度为100 μg/ml的AGEs和50 μg/ml的oxLDL。分别继续培养12、24、36、48 h和72 h后，进行荧光染色。

　　1.4 Hochest33258荧光染色 固定各组细胞，PBS洗2遍，向其中加入Hochest33258(终浓度为5 μmol/L)，振荡混匀，37℃避光孵育25 min，PBS洗2遍，封片，于荧光显微镜下观察。

　　1.5 统计学方法 应用SPSS11.5软件进行单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 倒置显微镜观察 镜下可见正常对照组细胞呈梭形贴壁生长，细胞间连接紧密。模型组细胞数明显减少，细胞连接较松，上清液中有较多的浮起变圆细胞，细胞碎片也较多。12和24 h， 洛伐他汀组的内皮细胞贴壁好于丹酚酸B组;36，48和72 h，丹酚酸B组的内皮细胞贴壁好于洛伐他汀组。

　　2.2 荧光显微镜观察 模型组细胞体积明显缩小，胞浆减少，部分细胞核固缩，形成高亮蓝染的典型凋亡小体。12和24 h， 洛伐他汀组的内皮细胞贴壁良好，荧光显微镜下可见凋亡小体减少;36，48和72 h，丹酚酸B组的内皮细胞贴壁良好，荧光显微镜下可见凋亡小体减少。

　　2.3 各组细胞凋亡比较 12和24 h时，洛伐他汀组细胞凋亡率显著低于模型组，36，48和72 h时，丹酚酸B组细胞凋亡率显著低于模型组。见表1。表1 药物作用不同时间各组细胞凋亡率的比较

　　3 讨 论

　　DM患者心血管疾病病死率占DM总死亡率的75%以上〔2〕。DM患者AGEs内源性合成增加、分解代谢减少、外源性摄取增加，导致其体内AGEs水平上升。oxLDL是LDL经氧化修饰的产物，生理状态的血浆中可能仅存在少量轻度氧化的LDL，而DM患者LDL易被氧化修饰形成oxLDL。血管内皮细胞的损伤被认为是形成DM及其血管并发症的基础〔3〕。研究表明，DM患者体内AGEs与oxLDL导致内皮细胞凋亡与动脉粥样硬化之间有密切关系〔4，5〕。

　　现代DM治疗的原则要求不但要良好控制血糖，而且要延缓其并发症尤其是心血管并发症的发生。因此，进一步探讨DM致动脉粥样硬化的机制及寻找有效药物是目前研究的方向。传统药物丹参归心、肝经，药性微寒，味苦、无毒，是最常用的活血化瘀中药之一，具有祛瘀止痛、养血安神的功效。丹酚酸B则是丹参中重要的水溶性有效成分，由3分子丹参素与1分子咖啡酸缩合而成的酚酸类化合物〔6〕。本实验表明，丹酚酸B作为一种有效的内皮细胞保护剂，同洛伐他汀相比较，其抑制AGEs诱导高脂内皮细胞凋亡的作用发挥得较迟缓，但效果显著而且持久。因此，针对疾病发展的不同阶段，西医结合">中西医结合优势互补能否进一步提高DM致动脉粥样硬化的防治效果，值得深入探究。

参考文献

　　1 Makimattila S，Liu ML，Vakkilainen J，et al.Impaired endotheliumdependent vasodilation in type 2 diabetes.Relation to LDL size，oxidized LDL，and antioxidants〔J〕.Diabetes Care，1999;22(6):97381.

　　2 Sasso FC，Carbonara O，Nasti R，et al.Glucose metabolism and coronary heart disease in patients with normal glucose tolerance〔J〕.JAMA，2004;291(15)：185763.

　　3 Hsueh WA，Quinones MJ.Role of endothelial dysfunction in insulin resistance〔J〕.Am J Cardiol，2003;92(4A):107.

　　4 Peppa M，Uribarri J，Vlassara H.The role of advanced glycation end products in the development of atherosclerosis〔J〕.Curr Diab Rep，2004;4(1):316.

　　5 Kanauchi M，Tsujimoto N，Hashimoto T.Advanced glycation end products in nondiabetic patients with coronary artery disease〔J〕.Diabetes Care，2001;24(9):16203.

　　6 彭宗根，陈鸿珊.紫草酸B的药理作用研究进展〔J〕.中国药学杂志，2003;38(10)：7447.