侧脑室注射谷氨酸、MK801及氯氨酮对大鼠吗啡戒断症状的影响

【摘要】 目的 研究中枢N甲基D天冬氨酸受体(NMDA)系统的功能变化与吗啡依赖大鼠戒断症状的关系。方法 建立吗啡依赖大鼠模型，纳洛酮催瘾后，分别侧脑室注射谷氨酸、MK801、 氯氨酮，观察其对大鼠戒断症状的影响。结果 谷氨酸使大鼠咬牙、湿狗样抖动、扭体、添阴茎、体重减轻等项体征的评分显著增高，而MK801及氯氨酮则相反。结论 中枢NMDA系统的功能变化可显著影响吗啡依赖大鼠的戒断症状。本研究为用非阿片类药物治疗阿片耐受和成瘾提供了实验依据。

【关键词】 谷氨酸;MK801;氯氨酮;吗啡戒断症状;大鼠

　　ABSTRACT: Objective To study the relation between the level of central NmethylDaspartate (NMDA) receptor system and the degree of morphine withdrawal syndrome in rats. Methods We established the morphinedependence model in rats， stimulated addiction by naloxone after intracerebroventricular injection of glutamic acid/ketamine/MK801， and then observed the effects on rats morphine withdrawal syndrome. Results Glutamic acid significantly raised the behavior scores of teeth chattering， wet shakes， writhing， penis licking and weight loss， while ketamine and MK801 decreased the scores. Conclusion Changes of central NMDA system obviously affect morphine withdrawal syndrome in rats， which may be useful laboratory evidence in selecting new noopiod therapeutic medicine for morphine resistance and addiction.

　　KEY WORDS: glutamic acid; MK801; ketamine; morphine withdrawal syndrome; rat

　研究表明，在吗啡耐受和依赖动物，非竞争性和竞争性N甲基D天冬氨酸受体(NMDA)受体拮抗剂及甘氨酸受体拮抗剂能明显抑制和逆转吗啡耐受的发生，阻断阿片类戒断综合征。目前这类药物已进入吗啡耐受和依赖治疗的临床前研究和临床应用。本研究分别给大鼠侧脑室注射(icv)谷氨酸、MK801、氯氨酮，借以改变大脑中NMDA系统的功能，观察其对大鼠吗啡戒断症状的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品与试剂 盐酸吗啡及氯氨酮为青海制药厂出品;纳洛酮由美国RBI公司购进;谷氨酸、MK801均购于Sigma公司。

　　1.2 吗啡依赖动物模型的建立 选用体重为200～250g的健康雄性Wistar大鼠(由河南科技大学机能实验中心提供)，侧脑室(前囟后1mm，中线旁开1mm，进入深度4mm)埋植注射用不锈钢管(外径0.8mm，总长7mm)，术后两天皮下递增注射吗啡建立吗啡依赖模型。5d内注射剂量依次为每千克体重5、10、20、40、50mg，每日3次(8:00、12:00、16:00)，5d后动物即可产生吗啡依赖。

　　1.3 实验动物分组 随机分为8组：对照组(NS组)及7个治疗组(包括3个不同剂量的谷氨酸治疗组、3个不同剂量的MK801治疗组、1个剂量的氯胺酮治疗组)，每组8只。NS组在产生吗啡依赖后的次日，停止注射吗啡，并于上午8:00将连接微量注射器的聚乙烯插管(尖端带有0.4mm外径的不锈钢插管)插入侧脑室瘘管内，缓慢推注生理盐水(NS)10μL，30s内注射完毕;5min后腹腔注射纳洛酮(0.5mg/kg体重)催瘾，1min后即出现各项戒断症状，观察60min内各项戒断反应的强度。治疗组则侧脑室注射 10μL药液以替代NS，其他操作同NS组。

　　1.4 戒断症状的评分[1] 评分标准为直接记录咬牙(teeth chattering， TC)的阵数、湿狗样抖动(wet shakes， WS)、扭体(writhing， WR)、舔阴茎(penis licking， PL)等项体征的次数。体重减轻(weight loss， WL)以测量其实际丢失的克数表示。

　　1.5 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件进行统计学分析。各戒断症状得分均符合正态分布，用均数±标准差(±s)表示。多组均数间的比较采用方差分析，各治疗组与对照组的比较采用Dunnettt检验。检验水准定为0.05。

　　2 结 果

　　2.1 NS组的戒断症状 8只对照组大鼠60min内各项戒断症状的评分见表1。表1 纳洛酮催瘾引起的吗啡戒断症状

　　2.2 侧脑室注射谷氨酸可加重吗啡的戒断症状 给3组吗啡依赖大鼠分别侧脑室注射3种不同剂量的谷氨酸(25、50、100μg)，5min后再用纳洛酮催瘾，并与NS组大鼠相比较。结果表明，不同剂量的谷氨酸在催瘾后均不同程度地加重吗啡戒断反应。经统计学处理后发现各项戒断症状中100μg组显著高于NS组(图1)。

　　2.3 侧脑室注射MK801对大鼠吗啡戒断反应的影响 MK801为NMDA受体非竞争性抑制剂。给3组吗啡依赖大鼠分别icv 3种不同剂量的MK801(25、50、100μg)，5min后再用纳洛酮催瘾。实验结果表明，不同剂量的MK801抑制各项吗啡戒断症状的作用非常明显，并呈一定的量效关系。经统计学处理，50μg及100μg组的戒断症状与NS组比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01，图2)。

　　*P<0.05， **P<0.01 vs. NS group

　　2.4 侧脑室注射氯氨酮对吗啡戒断反应的影响 给1组吗啡依赖大鼠侧脑室注射氯氨酮100μg，结果显示氯胺酮能明显抑制纳洛酮诱发的各项戒断症状(P<0.01，图3)。

　　3 讨 论

　　阿片类药物的依赖机理较为复杂，目前有许多不同的观点。多数人认为吗啡可抑制动物脑干蓝斑核[23](LC)去甲肾上腺素(NE)的释放，吗啡戒断后蓝斑核脱抑制，引起NE神经元活跃，NE释放增加。阿片戒断引起脑内NE释放增加可导致各种戒断症状，其受体后机制与Gs的激活提高了腺苷酸环化酶的活性，使细胞内cAMP的生成增加有密切的关系。

　　谷氨酸是脑内重要的神经递质，其受体多样，分为代谢型和离子型，后者又分NMDA型和非NMDA型。其中NMDA型受体与阿片类药物依赖及戒断症状有密切的关系[4]。

　　侧脑室注射谷氨酸能明显加强吗啡戒断症状发生;相反氯氨酮以及MK801均为谷氨酸的非竞争性NMDA 受体拮抗剂，侧脑室注射后能明显抑制吗啡戒断症状发生。可见NMDA受体的激活与否，在阿片依赖与戒断中起着重要的调控作用。其相互作用机制尚不清楚，主要与以下因素有关。

　　①蓝斑核因素。含大量去甲肾上腺素能神经元的蓝斑核与躯体依赖的形成密切相关。阿片滥用急性期引起蓝斑核内NE能神经元放电频率降低，慢性期则可见其放电频率逐渐恢复，而已成瘾后给予阿片拮抗剂，则此神经元放电频率突升，引起 NE的大量增加和躯体戒断症状的表现。有研究发现在阿片戒断时，LC神经元放电、谷氨酸和天冬氨酸水平均明显增加，提示兴奋性氨基酸释放与LC神经元兴奋有关[5]。免疫组化证明在蓝斑核、伏隔核、杏仁核及脊髓中均有大量NMDA 受体分布[6]。本实验中谷氨酸明显加强吗啡戒断症状的发生，可能是因谷氨酸与NMDA 受体结合，阳离子通道选择性开放，大量Ca2+、Na+内流和K+外流，引起膜去极化，导致LC神经元放电增多所致。而非竞争性NMDA受体拮抗剂氯氨酮以及MK801则与NMDA离子通道内部PCP位点结合，阻断NMDA受体耦联的Ca2+通道激活，使Ca2+内流减少，从而使NMDA受体的药理效应减弱。

　　②伏隔核和杏仁核因素。研究显示，伏隔核和杏仁核中兴奋性氨基酸转导系统在阿片依赖的引发中有重要作用[78]。应用谷氨酸受体拮抗剂及谷氨酸转运体激活剂都能减少纳洛酮导致的小鼠的戒断症状[9]。吴红海等[10]利用大鼠吗啡依赖模型，发现吗啡戒断时大鼠伏隔核的谷氨酸系统处于兴奋状态，由纳洛酮诱发的戒断症状的出现均伴随大鼠伏隔核内谷氨酸浓度的上升。冀栋等[11]在伏隔核内注入0.4～10μg的氯胺酮即可显著抑制戒断症状，伏核的有效剂量(平均4μg)仅为全身用量(16.4mg/kg)的0.1%，说明伏核可能是氯胺酮抑制戒断症状的主要作用部位。

　　③NMDANOcGMP通路。研究表明，NO、NMDA受体和cGMP之间存在着内在联系，即存在着NMDA受体NOcGMP通路。吗啡戒断时，可大量释放谷氨酸作用于NMDA受体，引起Ca2+内流增加，激活NOS产生NO，促进 cGMP 合成，引起细胞功能的一系列变化，导致戒断症状的发生。并指出氯胺酮、MK801缓解大鼠吗啡戒断症状的可能机理是：氯胺酮与NMDA受体的苯环哌啶位点非竞争性结合，减弱了NMDA受体的药理学活性，抑制了NMDA受体兴奋，从而抑制了NMDANOcGMP信号通路，起到缓解大鼠吗啡戒断症状的作用[12]。但应注意的是，MK801、氯胺酮虽然可减轻戒断行为，但本身可引起某种程度的共济失调[13]。因此，需特别强调非竞争性NMDA受体拮抗剂的剂量问题，应选用合适剂量以分离其对阿片戒断症状的抑制效应和导致运动失调的副作用。

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