摘 要：目的： 研究通关藤对U937细胞凋亡效应与调控及周期改变。方法：应用噻唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度通关藤对U937细胞的增殖抑制作用，以Annexin-Ⅴ/PI双染法检测细胞凋亡，以RT-PCR法检测bax、bcl-2、p53的基因表达水平的改变。结果：10、20、40、80μL/ mL通关藤对U937细胞染毒24h后，细胞相对增殖率为93.33%、86.20%、76.42%、56.75%，10、20、40、80μL/ mL 通关藤对U937细胞染毒24h后的凋亡率为5.67%、7.51%、13.49%、21.61%，10、20、40μL/ mL 通关藤对U937细胞染毒24h后bax/bcl-2的比值为1.35、2.58、4.45，p53的相对表达水平为1.57、2.36、3.57。结论： 通关藤能抑制U937细胞生长，诱导细胞发生凋亡，且具有剂量反应关系，其凋亡的机制可能与Bax/Bcl-2的上升，及p53的mRNA表达的上调有关。
关键词：通关藤；U937细胞；细胞毒性；Bax/Bcl-2；P53
近年来，传统中药通关藤在实体瘤的临床治疗中取得了较好的疗效[1-3]。但通关藤注射液在血液肿瘤治疗中应用较少。有研究表明，低浓度的通关藤可诱导白血病 NB4 细胞分化， 高浓度可通过 线粒体途径诱导白血病细胞U937， HL60凋亡[4-5] 。为进一步探讨通关藤抗白血病的作用及相关凋亡的可能机制， 本文用体外对U937细胞进行不同浓度的通关藤染毒，观察对U937细胞的抑制作用，对细胞凋亡、细胞周期的影响并检测相关基因的表达。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株：
U937 细胞购自中科院上海细胞库。
1.1.2 主要试剂及仪器：
通关藤注射液( 消癌平注射液， 20 mL/ 支， 批号:20070405111)、凯基活细胞/凋亡细胞/坏死细胞鉴别试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）；Mithras LB941多功能酶标仪（德国Berthold technologics），PCR仪(Eppendorf-AG)，凝胶成像处理系统(ChemilmagerTM 5500 Alpha innotech)，ABI 7300型荧光定量PCR仪（美国应用生物系统中国公司）。
1.2 方法
1.2.1 通关藤对U937细胞的增值抑制作用
以含10%胎牛血清的RPMI1640培养基正常培养细胞。实验时取对数生长期细胞以1×104个/孔接种于96孔培养板中培养24 h，用含通关藤终浓度为， 10、20、40、80μL/ mL的培养基100μl染毒24 h，每个剂量设3个平行。染毒结束后吸取培养基，加入含10% MTT的无血清培养基100μl作用4 h，再吸取培养基，加入150 ?l DMSO溶解蓝紫色结晶物，每孔平行吸取三次各150 ?l到96孔板在酶标仪上选择490 nm波长测定各孔吸光度值(A)。按公式计算各组细胞相对增值率， 细胞相对增值率(%) = (各染毒组A值-空白组A值) ×100% /（阴性对照A值-空白组A值)。
1.2.2 通关藤对U937细胞凋亡作用
取对数生长期细胞以2×105 个/孔接种于六孔培养板中培养24 h。剂量效应研究：用含通关终浓度为0、10、20、40、80μl/ml的培养基3ml分别染毒24 h；每组设3个平行。染毒结束后，胰酶消化，离心（2000转，5min）收集细胞，用PBS洗涤细胞2次（2000转，5min），加入500μL 的Binding Buffer 悬浮细胞；加入5μL Annexin V-FITC混匀后，加入5μL Propidium Iodide，混匀。室温，避光，反应15min。用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488nm；发射波长Em=530nm。Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道（FL1）检测；PI红色荧光通过PI通道（FL2或FL3）检测。
1.2.3 通关藤对U937细胞Bax、Bcl-2 和 p53表达影响
同以上染毒方法获取细胞，trizol法提取总RNA，用RT-PCR 方法检测肿瘤细胞Bax、Bcl-2 和 p53基因表达。设计引物如下：Bax引物：上游：5’-GGTGCCTCAGGATGCG-3’，下游：5’-GGAGTCTGTGTCCACG-3’，扩增片段115bp；Bcl-2引物：上游：5-TCGATGTGATGCCTCTGCGAAGAAC-3’，下游：5’-ATTGCACTGCCAAACGGAGCTG -3’，扩增片段112bp；以β-actin为参比基因：上游：5’-ATCCGCAAAGACCTGT-3’，下游：5’-GGGTGTAACGCAACTAAG-3’，扩增片段293bp。反应条件：95℃预变性3 min，变性15s（95℃），退火1min（60℃），40个循环。
1.2.5 统计学方法
采用 SPSS 13. 0 软件进行分析，资料以?x±s 表示，计量资料组间差异采用单因素方差分析。
2.1 通关藤对U937细胞的增值抑制作用
MTT结果显示，对照组相比，不同染毒浓度下作用24h后的细胞相对增殖率低于对照组，，且具有统计学差异（表1）
表1 U937细胞在通关藤不同浓度作用24h后的吸光度(x±s，%)
*与对照组相比，P&<0.05.
2.2 通关藤对U937细胞的凋亡作用
根据流式细胞仪检测结果，随着通关藤浓度的增高，U937的凋亡率在10~80μL/ mL时分别为4.67%、6.8%、11.93%、20.70%，且随着通关藤浓度上升而逐渐上升，与对照组相比具有统计学差异(表2)。
表2 U937细胞在通关藤不同浓度作用24h后凋亡率（100%）
*与对照组相比，P&<0.05.
2.3 通关藤对U937细胞Bax、Bcl-2和 p53表达影响
10、20、40μL/ mL通关藤作用24h后， U93细胞bax、bcl-2、p53基因表达水平均有所上调，Bax的mRNA相对表达水平分别为1.52、2.48、3.78，随着浓度上升而表达上升，且与对照组相比具有统计学差异，Bcl-2的相对表达水平为1.13、0.96、0.85，Bax/bcl-2值则分别为1.35、2.58、4.45，P53的相对表达水平为1.57、2.36、3.57，与对照组相比具有统计学差异(表3)。
表3 不同浓度通关藤作用24h后对U937细胞bax，bcl-2，p53基因相对表达水平的影响
*与对照组相比，p&<0.05.
3 讨 论
现代干细胞理论认为，白血病是造血干祖细胞发生恶性变化所致的恶性增殖性疾病。各种类型的白血病通常有特征性的细胞遗传学异常。本研究通过用通关藤对U937细胞进行体外染毒，研究其细胞凋亡效应，并且通过检测bax、bcl-2、p53三个基因的mRNA表达水平来研究其可能机制。研究结果表明，通关藤对U937细胞具有增殖抑制效应，并能够诱导U937细胞凋亡。RT-PCR结果显示，bax/bcl-2的比值上调，p53的表达水平也上升。Bcl-2 和 Bax 是 Bcl-2 家族中两个典型的抑凋亡和促凋亡蛋白，且二者通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡。当Bax形成同源二聚体时诱导细胞凋亡；Bax与 Bc1-2形成异源二聚体时则实现Bcl-2 抑制细胞凋亡的功能[6]。Bax与Bcl-2的比值决定同源二聚体(Bax/Bax)与异源二聚体(Bcl-2/Bax) 的比值，这对决定细胞是否进入凋亡状态有重要意义。P53有影响细胞周期，引导细胞凋亡作用。实验中，P53的表达也随通关藤浓度的增加而出现增加的趋势。根据以上的结果分析，通关藤诱导HELF细胞凋亡的机制可能与Bax/ Bcl-2的上升，及p53的mRNA表达上调有关。
参考文献
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[3] 王文荣， 崔生达， 曾黎明. 中药消癌平配合超声引导经皮射频治疗中晚期肝癌的Ⅱ期 临床观察 [J] . 中国西医结合">中西医结合杂志， 2003，23( 1) : 89-90.
[4] 李东， 欧阳建， 李翠萍， 等. 通关藤对白血病细胞U937，HL60细胞凋亡作用的实验研究[ J] . 中国生化药物杂志， 2008， 29( 1 ) :33-37.
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[6] Lalier L，Cartron PF，Juin P，et a1. Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis[J]. Apoptosis，2007， 12(5): 887－896.