关于CEA siRNA载体的构建和转染人食管癌EC9706细胞的沉默作用

【摘要】 目的：应用RNA干扰技术，构建针对CEA的siRNA载体，抑制人食管癌EC9706细胞CEA基因的表达. 方法：依据设计siRNA的原则，针对人CEA的mRNA序列，设计并合成编码siRNA的两对寡核苷酸序列，经退火成互补双链，克隆入载体pRNATU6.2中构建重组体pRNATU6.2CEA，筛选、鉴定. 然后转染重组体至人食管癌EC9706细胞中，经G418筛选，获得阳性克隆，并以空质粒转染和未进行转染的EC9706作对照，运用PCR和Western Blot检测CEA的表达. 结果：测序鉴定证实目的寡核苷酸片断已被克隆到pRNATU6.2载体中，pRNATU6.2CEA转染人食管癌EC9706细胞后，CEA基因表达在mRNA和蛋白质水平都受到显著抑制. 结论：成功构建了针对人食管癌EC9706细胞的siRNA载体，可有效抑制CEA的表达，为进一步从分子水平探讨CEA的功能奠定了基础.
【关键词】 EC9706细胞系 干扰RNA 癌胚抗原
0引言
　　CEA（carcinoembryonic antigen）属于非器官特异性肿瘤相关抗原，它不仅作为一种单纯的肿瘤标志物存在，而且是与肿瘤恶性化有关的一种复杂的分子. 但目前对于CEA分子水平的研究主要集中在肿瘤治疗前、治疗中、治疗后CEA表达的变化及其与肿瘤诊断、治疗、预后的关系［1-3］. CEA与肿瘤的发生发展及转移有无内在联系，对治疗过程有什么影响，文献中未见深入报道. 本研究利用RNA干扰技术，构建针对CEA的小分子干扰RNA (small interfering RNA， siRNA)表达载体，并转染EC9706细胞，旨在实现对CEA表达的抑制，为进一步从分子水平探讨CEA功能及对治疗的影响打下基础.
　　1材料和方法
　　1.1材料人食管癌EC9706细胞系由中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室惠赠. 大肠杆菌Top10， pRNATU6.2质粒由郑州大学免疫与微生物教研室提供. 限制性内切酶、逆转录酶、 Real Time PCR扩增试剂盒均为TaKaRa产品. 鼠抗人CEA及βactin mAb和酶标羊抗鼠IgG为Sigma公司产品. CEA基因RNAi寡核苷酸，CEA基因和βactin基因PCR引物均由上海生物工程公司合成测序.
　　1.2方法
　　1.2.1引物设计在GenBank中查找人CEA的mRNA全序列，通过Blast软件确定与其它非相关基因无同源性，按照pRNATU6.2载体的要求设计编码siRNA的寡核苷酸链. 设计的siRNA两对寡核苷酸序列如下：SCEA1上游引物为5′TGATGGCAACCGTCAAATTATTC AAGAGATAATTTGACGGTTGCCATCTTTTTTC3′，下游引物为5′TCGAGAAAAAAGATGGCAACCGTCAAATT ATCTCTTGAATAATTTGACGGTTGCCATCA3′；SCEA2上游引物为5′TGATGTAGGACCCTATGAGTTTCAAG AGAACTCATAGGGTCCTACATCTTTTTTC3′，下游引物为5′TCGAGAAAAAAGATGTAGGACCCTATGAGTTC TCTTGAAACTCATAGGGTCCTACATCA3′. Real Time PCR一对引物5′ACCACAGTCACGACGATCAC3′， 5′CGCTGTGGTCAACACTTAAT3′.
　　1.2.2siRNA表达载体的构建将合成的寡核苷酸单链稀释后退火成双链，连接到siRNA载体pRNATU6.2，将重组载体转入感受态细菌（Top10），筛选，PCR验证后提取质粒，并做双酶切和测序鉴定.
　　1.2.3细胞转染取pRNATU6.2SCEA1，SCEA2重组体及空载体分别转染对数生长期的EC9706细胞，转染方法参照LipofectamineTM 2000转染试剂操作说明进行，转染24 h后用G418(浓度400 mg/L)筛选，待细胞稳定后收集，同时收集同批未进行转染的EC9706作为阴性对照，分别命名为干扰1组、干扰2组、空载体组及对照组.
　　1.2.4Real Time PCR分析Trizol法提取转染细胞和对照细胞的总RNA（方法按试剂盒说明），逆转录合成cDNA第一链（Gbico公司反转录试剂盒及说明）. 标准曲线的建立：将βactin质粒标准品原液按梯度稀释成0.1，0.05，0.025，0.0125，0.00625拷贝/L. 使用Real Time PCR扩增仪进行荧光定量PCR检测，反应条件中加入溶解曲线的制备.
　　1.2.5Western Blot检验CEA蛋白的表达培养细胞蛋白质样品的制备：收集各组细胞，用细胞裂解液和蛋白保护液裂解细胞，经涡旋离心后取上清，紫外分光光度计测定蛋白浓度备用；制备SDSPAGE凝胶，并做预电泳；每孔加样品40 μg，Marker加10 μL，电泳；染色和脱色，切胶.电转；封闭，加1抗孵育，TBST洗后加酶标2抗；TBST洗后，显影，定影；用βactin作内参照验证蛋白的含量.
　　统计学处理： 组间比较采用单因素方差分析， P&<0.05认为差异有统计学意义.
　　2结果
　　2.1重组体鉴定结果
　　2.1.1酶切鉴定重组质粒经限制性内切酶双酶切后得到大于2000 bp的条带和小于100 bp的条带，与质粒和目的条带的大小相符(图1).
　　1：pRNATU6.2SCEA1；2：pRNATU6.2SCEA2；3：marker.
　　图1重组载体的双酶切鉴定
　　2.1.2测序鉴定经过筛选的重组体pRNATU6.2SCEA1，SCEA2测序结果，与设计靶向CEA的寡核苷酸序列比较完全一致(图2).
　　图2重组体插入片断（SCEA1，2）的测序结果
　　2.2CEAsiRNA转染EC9706细胞的Real Time PCR鉴定
　　2.2.1标准曲线的建立和回归方程用SPSS11.0软件对βactin质粒稀释浓度的对数和相应的拷贝数进行直线回归分析. 得到的直线回归方程为lgY=-0.575-0.397X. 模板的溶解曲线显示为单峰，且峰值单一，说明产物特异（图3）.
　　图3Real Time PCR熔解曲线
　　2.2.2样品的定量检测分别以CEA和βactin为引物扩增样本， 其CT值代入标准曲线方程， 求出相应的mRNA含量， 并求出样本中CEA mRNA对βactin mRNA的相对含量，对照、空载体（pRNATU6.2）、干扰1（pRNATU6.2SCEA1）及干扰2（pRNATU6.2SCEA2）分别为：0.18±0.11，0.19±0.10，0.06±0.02，0.05±0.03. 干扰1组、干扰2组与对照组及空载体组相比，都有显著统计学意义（P&<0.01）.
　　2.3CEAsiRNA转染EC9706细胞的Western Blot鉴定干扰1组和干扰2组与对照组、空载体组相比蛋白条带明显减弱（图4).

1：对照；2：空载体；3：干扰1；4：干扰2.
　　图4Western Blot鉴定结果
　　3讨论
　　CEA是一种胚胎性致癌抗原，主要存在于胎儿消化道上皮组织、胰腺和肝脏中，成人消化道可产生少量CEA，在胆道、羊水、肺、乳腺等组织中也可见少量CEA. 约95%的结直肠癌、胃癌、胰腺癌、大多数非小细胞型肺癌、头颈鳞癌及约50%的乳腺癌有CEA表达［4］. Nakashima等［5］用RTPCR方法对54例食管癌外周血CEA mRNA进行检测，发现阳性率为57.4%，且阳性患者的肿瘤复发率明显高于阴性患者. 我们在研究复制选择性溶瘤腺病毒时发现CEA在对溶瘤病毒敏感和不敏感肿瘤细胞中的表达有较大差异，同时检测到CEA在人食管癌EC9706细胞中高表达，而且食管癌对溶瘤腺病毒敏感性不高. 因此，希望通过RNA干扰技术构建CEA siRNA载体来降低EC9706细胞中CEA的表达，以进一步探讨CEA的内在功能及对溶瘤腺病毒抗食管癌的效果有无改善.
　　RNA干扰(RNA interference， RNAi)是近年发现的一种重要基因沉默技术，又称转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing， PTGS)［6］. RNAi技术近年来发展迅速，已成为分子生物学研究的主要技术手段之一，在功能基因组研究、信号转导研究及基因治疗方面显示出巨大的前景. 研究表明，利用质粒或病毒载体体内合成的siRNA，体内抑制目的基因的效果与合成siRNA相似， 但却花费低、 成本小，还可克服合成siRNA可能造成的RNase的污染［7］.
　　本研究利用pRNATU6.2载体，构建的重组体转染细胞后，siRNA将持续产生，并通过识别、降解具有同源序列的mRNA最终干扰目的基因的表达，同时载体上带有免疫荧光标记利于观察重组质粒的转染效率. 本实验构建的针对CEA的siRNA表达载体成功的转染EC9706细胞， 用Real Time PCR及Western Blot方法从mRNA和蛋白质水平检测表明转染特异的siRNA能够抑制人食管癌EC9706细胞中CEA的表达，基因沉默的效果显著. 这证实我们可以通过RNAi技术调控CEA表达，为进一步探讨CEA的功能及对溶瘤腺病毒的杀伤效果有无影响及作用机制奠定了基础.

参考文献

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