作者：叶云 欧建平 吴日然 林秀峰 廖月婵 杜静 杜彦
【摘要】 【目的】 探讨血清抗苗勒管激素(AMH)水平预测卵巢储备力及在控制性超排卵(COH)中对卵巢反应性的预测价值并指导临床。 【方法】 回顾性分析2009年6月至12月在本中心接受IVF/ICSI-ET治疗的416周期。根据患者COH卵巢反应将患者分为3组：卵巢低反应组67例、卵巢正常反应组319例、卵巢高反应(OHSS)组30例。根据是否发生中重度OHSS分为OHSS组12例，非OHSS组404例。清晨空腹静脉血测定AMH(无月经周期限制)和FSH、LH、E2水平(月经第2 ～ 5天抽血)，同时行阴道B超检查测定窦卵泡数(AFC)。以获卵数为评价标准进行诊断试验的诊断价值评价。【结果】 与获卵数的相关性由强到弱是AMH水平、AFC、FSH/LH比值、基础FSH水平、基础LH水平，控制年龄因素后的偏相关系数分别为 0.494、0.414、-0.310、-0.261、0.233(P &< 0.01)。预测卵巢低反应ROC曲线下面积除年龄外的前3项为AMH水平0.901、AFC 0.889、FSH/LH比值0.734;AMH水平界值≤1.795 μg/L，其Youden指数为0.629，高于其他指标。预测卵巢高反应ROC曲线下面积前3项为AFC 0.882、AMH水平0.828、FSH/LH比值0.759;AMH水平界值≥3.725 μg/L，其Youden指数0.558，仅次于AFC的0.661。预测OHSS时ROC曲线下面积前3项为AMH水平0.879、AFC0.838、FSH/LH比值0.716;AMH水平界值≥5.690 μg/L，其Youden指数0.655，高于其他指标。AMH水平、年龄和总促排剂量与获卵数的多元回归模型：获卵数(个) = 5.802 + 1.080 × AMH(μg/L)。 【结论】 血清AMH水平能反应卵巢的储备力，可以在COH前预测卵巢反应和获卵数，是良好的卵巢反应预测指标之一，对临床用药有良好的指导意义。
【关键词】 血清抗苗勒管激素; 控制性超排卵; 卵巢反应性; 卵巢过度刺激
Abstract： 【Objective】 This study was designed to investigate whether serum anti-Müllerian hormone (AMH) level would be the better predictor of ovarian response in controlled ovarian hyperstimulation (COH). 【Methods】 From January 2009 to December 2009， 416 cycles of IVF/ICSI-ET were recruited. The patients were classified into 3 groups including poor response (n = 67)， normal response (n = 319)， and over response (n = 30) according to ovarian response to COH. There were 12 cases of severe ovarian hyperstimulation syndrome (OHSS) other for 404 cases were not severe. Serum AMH levels on anyone day of menstrual cycle was determined. On day 3 the number of early antral follicles count (AFC) and the levels of serum follicle stimulating hormone (FSH)， luteinizing hormone (LH)， estradiol (E2) concentrations were also determined in these patients. 【Results】 After control age， the correlation efficiencies between oocyte counts and the AMH level， AFC， FSH/LH， basal FSH level and basal LH level were 0.494， 0.414， -0.310， -0.261， and 0.233， respectively (P &< 0.01). To forecast the poor response， relative operating characteristic (ROC) area descend turn was AMH level 0.901， AFC 0.889， age 0.776， FSH/LH 0.734， basal FSH 0.664，basal LH 0.429， basal E2 0.475. When 1.795 μg/L was selected as the AMH cut-off value， the Youden's index was 体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)技术已广泛用于治疗不孕症。卵巢低反应和卵巢过度刺激(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)是导致治疗周期取消的主要原因。如何在控制性超排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)治疗中正确评价卵巢的储备能力及其对COH的反应性，寻找评估卵巢储备功能的理想指标，预防卵巢低反应和卵巢过度刺激的发生，一直是生殖领域的研究热点之一。国外的新近研究发现，血清抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)水平在COH中对卵巢低反应及卵巢过度刺激均有着良好的预测价值[1-3]，国内也有研究认为AMH对卵巢低反应的预测价值最高，但是COH前能否通过AMH筛选高危人群以预防OHSS发生，还需进一步临床研究[4]。为探讨血清AMH水平预测卵巢储备力及在控制性超排卵中对卵巢反应性的预测价值并指导临床，我们对本中心416个IVF/ICSI-ET治疗周期进行回顾性分析。
1 材料与方法
1.1 研究对象
2009年6月至12月在本中心接受IVF/ICSI-ET治疗共574周期，其中自愿进行血清AMH水平检测416周期。年龄23 ～ 45岁，平均年龄32(S = 4)岁。不孕年限1 ～ 16年，平均5.3(S = 3.4)年。其中原发性不孕193例，继发性不孕223例。主要的不孕因素：盆腔、输卵管因素271例，子宫内膜异位症40例，男性因素85例，排卵障碍12例， 反复IUI失败史7例，其他因素1例。
1.2 判断标准
根据患者超排卵反应将患者分为3组：卵巢低反应组，周期获卵数≤3个(包含未获卵或因卵巢无反应取消周期者)，67例;卵巢正常反应组，周期获卵数4 ～ 19个，319例;卵巢高反应组，周期获卵数≥20个，30例。根据卵巢过度刺激程度，中重度12例，诊断标准依据《生殖工程学》标准[5]：中度，有明显下腹胀痛，可有恶心、呕吐、口渴，偶伴腹泻，体质量增加≥3 kg，腹围增大，E2水平 &< 3 000 ng/L，卵巢增大明显，直径在5 ～ 10 cm之间，腹水 &< 1.5 L;重度，腹水明显增加，腹胀痛加剧，病人口渴、尿少、恶心、呕吐、腹胀至无法进食，大量腹水或胸腔积液致呼吸困难，不能平卧;卵巢直径 &> 10 cm，体质量增加 &> 4.5 kg，可有血液浓缩、高凝状态、电解质紊乱、肝肾功能异常。
1.3 观察指标
AMH、性激素水平及窦卵泡计数(antral follicle count， AFC)测定：患者在IVF/ICSI治疗前，抽取清晨空腹静脉血(无月经周期时期限制)检测AMH水平;月经来潮第2 ～ 5天抽取清晨空腹静脉血检测FSH、LH、E2，同时行阴道B超检查(ALOKA SSD-3500型超声仪，探头频率7.2 MHz，日本)测定AFC。
1.4 实验室方法
AMH水平用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)方法测定，使用美国DSL公司的AMH试剂盒。最低检测限度是0.006 ng/ml，室内质控变异系数 &< 5%。血清FSH、LH、E2水平测定采用化学发光法(chemiluminescent microparticle immunoassay， CMI)方法测定，使用德国罗氏公司的ELECSYS试剂盒。严格按照试剂盒说明操作，室内、室间质控达标。
1.5 统计学方法
回顾性分析。应用SPSS统计学软件处理系统，各观察指标均进行正态性检验和方差齐性检验，对不符合的资料进行对数转换成后再进行分析，对经过对数转换仍不满足正态分布及方差齐性条件者改用非参数检验。采用两因素相关分析、多重比较的方差分析、两独立样本t检验(检验水平：双侧，α = 0.05)、多元线性回归分析、相对工作特征(relative operating characteristic， ROC)曲线和Youden指数等统计学分析。
2 结 果
2.1 相关性分析
AMH水平、 AFC、基础FSH水平、FSH/LH比值、基础E2水平、基础LH水平、年龄与获卵数的相关系数分别为0.561、0.511、-0.345、-0.375、 -0.077、0.254和-0.348，除基础LH水平外，其余P皆 &< 0.01。由于前列指标皆与年龄密切相关，因此控制年龄因素后再次行相关性分析，这些观察指标与获卵数的相关性由强到弱分别为AMH水平(0.494)、AFC(0.414)、FSH/LH比值(-0.310)、基础FSH水平(-0.261)、基础LH水平(0.233)，P皆&< 0.01。获卵数与基础E2水平的相关性无统计学意义。
2.2 AMH对卵巢储备力及卵巢反应的预测
2.2.1 各组AMH及各项指标的比较
如表1，表中7个观察指标正态性检验均符合正态分布。AMH、FSH、LH、FSH/LH、AFC方差齐性检验提示方差齐，用方差分析多重比较AMH、AFC、FSH/LH三组间两两比较差异均有统计学意义，FSH正常反应组与高反应组间差异无统计学意义、低反应组和其他两组间差异均有统计学意义，LH低反应组与正常反应组差异无统计学意义、高反应组与其他两组间差异均有统计学意义。E2方差不齐经对数转换后方差齐，三组间两两比较差异无统计学意义。年龄方差不齐用非参数检验，表中，三组间两两比较差异均有统计学意义。促排总促性腺激素(gonadotropic hormone， GnH)剂量高反应组与正常反应组、低反应组差异有统计学意义，正常反应组和低反应组差异无统计学意义。
2.2.2 各项指标对卵巢低反应的预测
本组416周期中发生卵巢低反应67例，发生率16.11%。如表2，可见预测卵巢低反应诊断价值由高到低为：AMH水平、AFC、年龄、FSH/LH比值、基础FSH水平。而基础LH水平(ROC下曲线面积为0.429)、基础E2水平(ROC下曲线面积为0.475)无诊断价值。
2.2.3 各指标对卵巢高反应的预测
本组416周期中发生卵巢高反应30例，发生率7.21%。如表3，可见预测卵巢高反应诊断价值由高到低为：AFC、AMH水平、FSH/LH比值、基础LH水平、基础FSH水平、年龄。而基础E2水平(ROC下曲线面积为0.459)无诊断价值。
2.2.4 各指标对卵巢过度刺激的预测
本组416周期中发生中重度OHSS 12例，发生率2.88%。如表4、5，可见，预测卵巢过度刺激诊断价值由高到低为：AMH水平、AFC、FSH/LH比值、基础LH水平、基础FSH水平。年龄诊断价值极低(ROC下曲线面积为0.564)、基础E2水平(ROC下曲线面积为0.430)无诊断价值。
2.3 预测获卵数的多元回归分析
以获卵数为因变量，以年龄、总GnH量、AMH水平为自变量进行多元回归分析，年龄和总GnH量两个变量的t检验值达不到显著性水平被从模型中剔除，得出回归模型方程：获卵数(个) = 5.802 + 1.080 × AMH(μg/L)。
3 讨 论
3.1 AMH与卵巢储备力
卵巢储备功能是指卵巢皮质区卵泡生长、发育、形成可受精卵母细胞的能力，包括卵巢内存留的卵泡数量和卵泡质量两方面内容，代表女性配子发生及甾体激素生成的能力，前者可反映女性的生育潜能，后者则决定女性绝经的年龄[6]。卵巢储备功能随着年龄的下降而下降，年龄是评价卵巢储备功能最主要的影响指标。但是，临床上患者存在极大的个体差异，部分患者由于内分泌疾病、盆腔手术史、肿瘤化疗等原因造成年龄与其卵巢的生物年龄并不同步，因此，正确评价卵巢的储备能力及其对COH的反应性，有助于指导生殖医生制定合理的促排卵用药方案， 以获得优质及适当数量的卵子，减少OHSS和卵巢反应不良的发生，减少周期取消率，提高IVF-ET的成功率及改善其预后。在评价卵巢储备功能方面，现已有年龄、基础FSH水平、基础E2水平、窦卵泡计数(AFC)、FSH/LH比值、克罗米酚试验等，目前最常用的是基础FSH水平、FSH/LH比值，结合年龄和AFC。近年来抑制素B(inhibin B，INHB)和AMH也受到很多的关注。AMH又名苗勒管抑制物质(Mü llerian hormone inhibiting substance MIS)，是由两个相同的70 kb亚基组成的二聚体糖蛋白，相对分子量为140 000，属蛋白质激素，是转化生长因子β(transforming growth factor TGF-β)超家族的一员。在男性，AMH 由睾丸间质细胞合成，诱导苗勒管的退化;而女性，AMH仅在卵巢表达。在对小鼠的mRNA研究中证实，AMH仅特异性表达在窦前卵泡及小窦卵泡的颗粒细胞上，而不表达在大的窦卵泡以及闭锁卵泡，在原始卵泡募集阶段，AMH抑制始基卵泡的募集，而在优势卵泡的选择过程中，AMH又降低生长卵泡对 FSH 的敏感性[7]。在对人类卵泡的研究中，也得到了在≤10 mm的小窦卵泡的卵泡液中AMH分泌水平和AMH mRNA表达最高，并随着卵泡的长大显著下降[8]。La Marca等[9]及Tsepelidis等[10]研究证明AMH在整个月经周期的波动极小，呈相对稳定状态，这意味着取血不受月经周期的限制，所以本研究中血清AMH的取血时间也没有进行周期限制，在临床上应用起来比AFC、基础FSH水平和FSH/LH比值更方便。
Van Rooij经过4 年时间随访81 例健康妇女的FSH，E2，INHB，AMH 及AFC 变化，认为AMH，AFC，FSH 和INH B 均和年龄呈相关性，且相关系数依次减低;E2水平和年龄无相关性[11]。此外，在Ficicioglu的研究中，相关性分析提示获卵数仅与AMH和AFC相关[12]。在本研究中，考虑到AFC、基础FSH水平、AMH水平、FSH/LH比值、基础LH均与年龄相关，所以我们对年龄因素进行控制后再进行与获卵数的相关性分析，结果是与获卵数的相关性由强到弱分别为AMH水平、AFC、FSH/LH比值、基础FSH、基础LH(均 P &< 0.01)，基础E2水平与获卵数的相关性无统计学意义。这与van Rooij的研究结果是一致的，我们的这一结果可以更好地解释不能单纯只以年龄来评估卵巢的生物年龄。有学者观察到在卵巢早衰的患者中，血AMH明显低于正常女性[13];而在多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)患者血AMH 水平[平均81.6 pmol/L(11.4 μg/L)]较非PCOS患者[平均33.5 pmol/L(4.69 μg/L)]明显升高[14]。在本研究中血清AMH水平、AFC、基础FSH水平、FSH/LH比值、基础LH水平在高中低反应组间比较差异有统计学意义(P &< 0.05)。提示AMH与临床常用的AFC、基础FSH水平、FSH/LH比值一样能反应卵巢的储备状态。
3.2 AMH对预测COH中卵巢的反应性
La Marca认为AMH水平可用于预测卵巢低反就和周期取消，同时可预测OHSS的发生[15]。我们应用ROC曲线和Youden指数对预测COH中卵巢反应性的常用指标的诊断价值进行了评价。①AMH对卵巢低反应的预测，诊断价值由高到低为：AMH水平、AFC、年龄、FSH/LH比值、基础FSH水平。在我们这一组患者当中，当AMH值以≤1.795 μg/L为界值时，预测卵巢低反应的灵敏度为0.821，特异度为0.808，Youden指数为0.629。与Ficicioglu和Gnoth的研究结论相同[12，16]。②AMH对卵巢高反应的预测暂未见相关文献报道。本研究中预测卵巢高反应的价值AMH水平仅次于AFC，高于FSH/LH比值、年龄、基础FSH。当AMH值以≥3.725 μg/L为界值时，预测卵巢高反应的灵敏度为0.9，特异度为0.658，Youden指数为0.558。③AMH对OHSS的预测，在Lee等的研究中，以基础AMH3.36 μg/L为预测OHSS的界值，敏感度90.5% (95% CI 69.6-98.5)，特异度81.3%(95% CI 75.8-86.0)，他们认为基础AMH水平可用于预测控制性超排卵中OHSS的发生[3]。我们观察到AMH水平在OHSS组为(10.3 ± 6.6)μg/L，明显高于在非OHSS组的(3.4 ± 2.8) μg/L(P &< 0.01)。AMH预测OHSS的ROC曲线下面积为0.879，选取界值≥5.690 μg/L时，灵敏度0.8330，特异度0.8220，Youden指数0.655，其诊断价值高于AFC、基础LH水平、FSH/LH比值、基础FSH水平。本研究12例OHSS的患者当中，只有2例AMH水平小于5.69 μg/L，这两例患者的BMI分别为16.71，16.56，并有过敏体质。可见预测控制性超排卵治疗时卵巢反应性，AMH水平和AFC是常用指标中最可靠的指标。由于AFC的检测较血清AMH水平更易受到检查者经验的主观影响，所以有理由赞同Rooij的观点：认为应用单一指标评估超排中卵巢反应时，AMH是最好的标志物[11]。
3.3 AMH水平用于预测COH中获卵数
Kwee的研究结果基础AMH和卵泡数呈线性回归关系 ■ = 7.06 + 2.48 × bAMH[17]。我们的直线回归方程：获卵数(个) = 5.802 + 1.080 × AMH(μg/L)，由此方程可以在促排卵前初步估计获卵数，有利于控制性超排卵方案的选择和启动剂量的调整，在临床上有着重要的应用价值。本组资料中，有两例患者均为PCOS患者，一侧卵巢AFC多达30 ～ 40个。1例30岁患者，AMH 22.03 μg/L，用口服避孕药1个周期同时常规长方案降调，促性腺激素2支/d启动，获卵泡数37个，卵子数20个，发生了中度OHSS;另1例25岁患者，AMH 21.72 μg/L，先用口服避孕药3个周期后再常规长方案降调，促性腺激素2支/d启动，获卵泡数19个，卵子数8个，未发生中重度OHSS。可见在促排前准确估计卵巢反应，适时调整COH方案，有利于预防OHSS的发生。
综上所述，AMH水平能反应卵巢储备状态，用于预测COH中卵巢反应性，有助于在COH前估计获卵数，有着方便、准确、可靠的优点，用于指导生殖医生制定合理的促排卵用药方案， 以获得优质及适当数量的卵子，减少卵巢过度刺激和卵巢反应不良的发生，减少周期取消率，提高IVF-ET的成功率及改善其预后有着重要的临床意义。
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