作者：张爱平 刘超 李越 刘长晖 陈丽伟， 葛璐璐， 陈晓晖
【摘要】 【目的】 应用SNaPshot技术建立23-plex Y-SNPs的复合扩增体系，研究其在法医学中的应用价值。【方法】 从Y染色体单体群命名树上选择23个Y-SNP位点：P164、P203、P148、P145、M89、P151、M216、P128、P157、P149、P131、P199、P123、P191、P201、M111、M9、P132、P200、P197、M119、P136和M134，进行复合PCR扩增，PCR产物纯化后利用荧光标记单碱基延伸技术(SNaPshot试剂盒)结合毛细管电泳技术对单核苷酸多态性进行检测，应用该体系调查了290名广东地区无亲缘关系的男性个体。【结果】 所建立的23个Y-SNPs检测体系，各位点均具有遗传多态性，基因多样性范围为0.013 7 ～ 0.491 2。在290名男性中检测到143个单体型，单体型多样性为0.990 7。【结论】 该23个Y-SNPs检测体系能快速而准确的对样本进行SNP分型，在法医学、人类学和相关学科的研究中具有较高的应用价值。
【关键词】 个体识别; 单碱基延伸(微测序); SNaPshot试剂盒; 单核苷酸多态性; Y染色体
Abstract： 【Objective】 To develope a robust single nucleotide polymorphism (SNPs) typing assay with co-amplification and to type 23 human Y chromosome SNPs using SNaPshot kit. 【Methods】 Markers were drawn from the phylogenetic tree of Y chromosome：P164，P203，P148，P145，M89，P151，M216，P128，P157，P149，P131，P199，P123，P191，P201，M111，M9，P132，P200，P197，M119，P136，and M134. All 23 Y-SNPs in one reaction were amplified; the pooled PCR products were purified. The minisequencing reactions were performed simultaneously for all 23 Y-SNPs with fluorescein-labeled dideoxynucleotides. A total of 290 male Chinese in Guangdong were genotyped by capillary electrophoresis and multicolour fluorescence detection. 【Results】 A 23-plex Y-SNPs co-amplification system was developed. All of the Y-SNPs are polymorphic in Chinese. The gene persity of the Y-SNPs ranged from 0.013 7-0.491 2. A total of 143 haplotypes were found， the haplotype persity was calculated to be 0.990 7. 【Conclusion】 The 23-plex Y-SNPs system developed is efficient， high-throughput and appears to be suitable for forensic science and anthroponomy.
人类Y染色体除拟常染色区外，绝大部分为非重组区，在减数分裂中不发生重组，以单倍型的形式呈男性伴性遗传，为男性所特有。因此Y-DNA序列携带男性迁徙、进化史的信息，被广泛应用于人类的起源和进化研究。虽然Y-STR标记多态性程度较高并已广泛应用，但与常染色体STR基因座一样，具有较高的突变率。Y-SNPs的突变率低，一个位点通常只有1次突变，也不易受重组的影响，因而是进化事件的忠实记录者，可以鉴定稳定的谱系关系，其所构成的单倍型组保持完整，已经被广泛应用于研究世界人群的历史、进化和迁移模式[1]，且其密度高、代表性强、遗传稳定性高、易于实现分析的自动化，因而又广泛应用于遗传疾病、药物学研究等各个方面[2]。通过对Y染色体SNPs单倍型的分析，可进行单亲案的父子亲缘鉴定，以及进行同一父系男性亲属关系的鉴定。同时Y染色体SNPs分布具有明显的地域性，可用于进行犯罪现场遗留的生物学个体所属群体的推断[3]。本实验采用复合PCR扩增技术，荧光标记单碱基延伸技术结合毛细管电泳检测，同时对多个Y-SNPs位点进行快速、准确、高通量的分型检测。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂
1.1.1 仪 器
480型扩增仪(Hema公司)，9700型PCR扩增仪(AB公司)，3130xl型DNA全自动遗传分析仪(AB公司)，7500型定量PCR仪(AB公司)。
1.1.2 试 剂
SNaPshot试剂盒(AB公司)、ExoSAP-IT (USB公司)、虾碱性磷酸酶SAP(1 U/?滋L， Fermentas， MBI)， Amp FL STR Profiler YfilerTM试剂盒(AB公司)、Quantifiler human DNA quantification 试剂盒(AB公司)、dNTPs混合物(Fermentas，MBI公司)。
1.2 材料及DNA提取
使用采血卡(公安部物证鉴定中心)或中性滤纸收集290份来自广东地区的无关男性个体的指尖血，用TECAN自动化工作站采用IQ磁珠法按照Promega公司的DNA IQTM系统——小样品案例操作手册进行DNA提取。
1.3 Y-SNP复合扩增体系的建立
1.3.1 Y-SNP位点的选择
根据Y染色体命名协会(The Y Chromosome Consortium) [4-6]的在线补充材料(附有可以用PCR方法检测的599个Y-SNPs位点及其组成的311个单体群的相关信息)，结合dbSNP数据库以及Y-SNPs信息的在线网站snp y reference database(http：//www.snp-y.org/)，并参考国内外文献筛选出在亚洲人群中多态性较高的单体群及对应的Y-SNPs位点23个：P164、P203、P148、P145、M89、P151、M216、P128、P157、P149、P131、P199、P123、P191、P201、M111、M9、P132、P200、P197、M119、P136、M134。其中M111是2 bp缺失，M199是1 bp插入，M134是1 bp缺失突变，其余位点均为碱基的转换或颠换。
1.3.2 引物设计与验证
以数据库筛选的位点及其邻近序列为模板，利用Primer Premier 5.0软件自行设计引物，并使用Oligo 6.0进行分析优化。引物设计原则：各位点的PCR引物的Tm相差2 ～ 5 ℃，避免引物间及引物自身二聚体及发夹结构的形成，引物的长度一般为15 ～ 30个核苷酸，G + C含量在40% ～ 60%之间，碱基要随机分布，扩增产物的片段长度在50 ～ 150 bp左右，引物高特异性(blast比对)。23对引物由上海生物工程公司合成，HPLC纯化。引物序列见表1。
1.3.3 单位点PCR扩增
以1个男性DNA样本定量后，分别用上述23个Y-SNPs位点引物对进行单独扩增，调整各项参数后，建立起适用于所选全部SNP位点的PCR扩增体系。最后，定出PCR反应体系为25 ?滋L，其中包含1 × PCR buffer(不含Mg2+)，1.5 mmol/L MgCl2，每种dNTP各200 ?滋mol/L，0.4 ?滋mol/L上下游引物，2.5 U AmpliTaq Gold DNA聚合酶，0.4 ～ 1 ng DNA模板。PCR反应条件为：95 ℃ 11 min，95 ℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环35次，最后延伸为72 ℃ 10 min。
1.3.4 单位点PCR扩增产物的检测
取2 ?滋L PCR产物与1.5 ?滋L 10 ×上样缓冲液混合后上样于6%非变性聚丙烯酰胺凝胶(C = 6%，T = 3.3%)[7]，450 V电泳3 h，银染显色。
1.3.5 复合PCR扩增体系的建立
使用单管包含23个Y-SNPs位点引物体系进行复合扩增，反应为25 ?滋L体系，含内含0.4 ～ 1 ng DNA 模板，1 × PCR buffer(AB公司，美国)， 8 mmol/L MgCl2(AB公司)， 每种dNTP各600 ?滋mol/L，PCR引物浓度在 0.006 8 ～ 0.067 6 ?滋mol/L，2.5 U AmpliTaq Gold DNA 聚合酶 (AB 公司)。复合扩增的循环参数为：95 ℃ 11 min，95 ℃ 30 s， 55 ℃ 40 s， 65 ℃45 s， 循环35次， 最后延伸为65 ℃ 10 min。
1.3.6 PCR产物的纯化
为防止多余的引物和dNTPs对后续的单碱基延伸反应(single base extension， SBE)引物的影响，在SBE之前用纯化剂去除多余的引物和dNTPs[8]。本试验取5 ?滋L PCR产物中加入2 ?滋L ExoSAP-IT 37 ℃孵育15 min，80 ℃ 15 min灭活，对PCR产物进行纯化。
1.3.7 单碱基延伸引物
用于单碱基延伸的引物的3′末端位于SNPs变异位点上游一个碱基处，用于检测插入/缺失突变的单碱基延伸引物的3′端位于插入/缺失碱基上游的一个碱基处，使得各引物延伸的第一个碱基即表示该位点的多态性[8]。为尽可能地实现高通量，通过“加尾”的方法设计不同长度的单碱基延伸引物，将23个位点进行配对组合，引物之间长度间隔为4 ～ 6个核苷酸，最终检测的产物长度范围在20 ～ 85个核苷酸之间。各SNP位点单碱基延伸引物见表2。
1.3.8 单碱基延伸反应(SBE)及产物纯化
采用SNaPshot试剂盒推荐的反应体系：纯化后复合PCR产物2 μL，微测序引物混合物2 μL， SNaPshot mix 4 μL，去离子水2 μL。循环参数与试剂盒推荐的control的反应条件一致： 96 ℃ 10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循环25次。在SBE反应之后向单碱基延伸反应产物中加入1 μL SAP(1 U/μL)，37 ℃孵育15 min，80 ℃ 15 min进行纯化处理，去除多余的引物和ddNTPs。
1.3.9 毛细管电泳和荧光检测
纯化后的SBE产物经AB 3130xl遗传分析仪进行电泳检测。取1 ?滋L SBE纯化产物加入10 ?滋L Hi-Di甲酰胺中，同时加入0.3 ?滋L GeneScanTM Size Standards LIZ-120(AB 公司)作为内标。进样时间为10 s，电压15 kV，POP-4凝胶，36 cm 毛细管，电泳30 min，电泳结束后，利用Genemapper ID V3.2软件进行结果分析。
2 结 果
2.1 微测序法对多位点Y-SNPs分型
某男性个体23-plex Y-SNPs的电泳图谱见图1，23个位点均得到稳定的分型，均为单倍型，各个位点扩增均衡，重复试验结果一致。
2.2 法医学参数的计算
等位基因频率和单体型频率用直接计数法统计，基因多样性(gene persity，GD)及单体型多样性(haplotype persity，HD)按公式h = n(1 - Σ?字2i)/(n - 1)计算[9]。23个Y-SNPs位点在广州汉族群体中均具有多态性，各个位点的基因多样性范围为0.013 7 ～ 0.491 2，在290名男性中共检测到143种单体型，单体型多样性为0.990 7。根据Y染色体协会的命名原则，共有12种单体群，单体群多样性为0.840 1。各个位点的群体遗传学数据见表3。
2.3 法医学应用
2.3.1 灵敏度
将浓度为200 ng/?滋L的参照DNA(AB公司Quantifiler human DNA quantification试剂盒的标准DNA)进行倍比稀释，分别进行复合PCR 和复合SBE反应。当25 ?滋L复合体系中DNA含量在0.1 ～ 50 ng时都能得到较好的分型结果(图2)。
2.3.2 种属特异性
对雄性的猴、猪、狗、黄牛、山羊、大白鼠、家兔、鸡八种动物各5例的血痕利用磁珠法提取DNA，并应用建立的复合体系进行扩增。在以上动物标本中均未检见任何Y-SNPs位点。猪的23-plex Y-SNPs的电泳图谱见图3，除去橙色内标外其余颜色未检见任何荧光峰。
2.3.3 组织同一性
同一男性个体的肌肉组织、骨骼、肋软骨、指甲、皮肤、肝脏、血痕等进行23-plex Y-SNPs复合检测，分型一致。
2.3.4 案例应用
从广州市公安局刑事技术研究所日常检案中收集的30份腐败检材(陈旧血痕、腐败肌肉、腐败肋软骨、白骨化长骨、牙齿等)，利用IQ法提取DNA， 用yfiler?誖PCR Amplification Kit(AB公司，美国)检测人Y-STR，同时用23-plex Y-SNPs复合扩增体系检测，对比两者的检出效率。结果显示，同一样本yfiler试剂盒的检出效率为50%左右(17个Y-STR基因座仅能检出6 ～ 8个)，Y-SNP体系的检出效率约为89%(23个Y-SNP位点可检出20个)。
对广州市公安局刑事技术研究所的10例怀疑强奸案阴道拭子或内裤及嫌疑人血样，用Identifiler?誖PCR Amplification Kit(AB公司，美国)检测STR，证实犯罪案件中内裤和阴道拭子上男性成分均与嫌疑人相同，用23-plex Y-SNPs复合扩增体系进行检测，结果与STR分型结果一致。
在珠江流域的河岸发现一具男性尸体，高度腐败，解剖后取肋软骨，除去表层腐败组织，用一次性消毒刀片刮下约5 mg，切碎，按照骨孵育液结合DNA IQ系统磁珠法对检材进行DNA提取。利用YfilerTM荧光Y-STR复合扩增试剂盒进行PCR扩增及STR分型检测，电泳结果如图4。
使用上述同样的DNA模板进行Y-SNPs检测分型，结果如图5所示，23个位点中有22个Y-SNPs 位点被检出。案件侦破后取无名尸父亲的DNA进行检测，与肋软骨分型相同。
3 讨 论
3.1 检测结果的分析判断
本课题中采用的SNaPshotTM是由4种不同荧光标记ddNTPs组成，各标记荧光所代表的碱基种类如表4所示。由于在SNaPshotTM 试剂盒中不同荧光物质标记的ddNTP所发射的荧光量有差异，FAM(蓝色)、HEX(绿色)、TAMRA(黄色)、ROX(红色)各荧光物质发射的荧光比约为4：2：1：1。Y染色体遗传标记为单体型，因此一般情况下无需判断纯合子与杂合子。但是在判读结果时需对不同荧光标记的RFU值进行标准化(除去由于不同荧光物质本身造成大的荧光强度差异)，以确定该位点的变异类型，以及非特异性峰。本文所要求的标准蓝色为400 RFU，绿色为200 RFU，黄色和红色为100 RFU，低于此标准的判定为杂峰。对30名个体进行测序验证该标准，发现与复合扩增结果一致，说明按此标准获得的结果可靠。
3.2 Y-SNPs复合检测体系的建立和优化
为实现复合扩增，所有PCR引物的Tm 在55 ℃ 左右( ± 2 ℃)，PCR引物长度之间差异不超过2 ～ 5个核苷酸，并将扩增的目的片段长度控制在53 ～ 146 bp内。通过正交实验方法，对PCR体系中各引物对浓度进行调整;在退火温度为55 ℃时复合扩增的效率和特异性都较好。实验中我们在复合PCR体系内增加MgCl2和dNTPs的浓度后，各位点的扩增效率得到明显提高。
将选择的23个Y-SNPs位点根据碱基变异类型进行配对，可以用相同或相近长度的单碱基延伸引物同时检测两个位点的两种多态性。单碱基延伸引物小于60个碱基的要经HPLC纯化，大于60个碱基的在HPLC纯化的基础上进行质谱检测，保证引物的纯化效果[10]。当利用正义链的PCR扩增产物无法设计出理想的单碱基延伸引物时，可根据反义链的PCR扩增产物设计引物，检测的变异类型与报道的互补。
PCR产物和SBE产物的纯化效果直接会影响分型结果。本实验利用酶纯化的方法简单易行且效果较好。
3.3 体系的多态性评估
利用建立的反应体系，对各位点在广州地区无关个体中的分布频率进行调查。发现所选的23个Y-SNPs位点在广州人群中均具有遗传多态性，其基因多样性(GD)范围为0.013 7 ～ 0.491 2，共检测到143种单体型，单体型多样性为0.990 7。
杜宏等[3]应用微测序法通过一个复合PCR体系和两个SBE体系检测了12个Y-SNP位点，获得了这12个位点在四川人群中的群体遗传学数据。12个Y-SNP位点只有M9和SRY8299在中国人群中检测出多态性，变异频率分别为5.1%和10.3%，多态性远远低于本课题建立的23-plex Y-SNPs复合扩增体系。
Sanchez等[8]应用微测序法通过一个PCR体系扩增25个DNA片段，一个SBE体系检测35个Y-SNP标记，获得了这35个标记在194名丹麦男性中的群体遗传学数据， 17个Y-SNP标记在丹麦人群中未检测到多态性。多态性程度低于本课题建立的23-plex Y-SNPs复合扩增体系。
本研究建立的Y-SNPs检测体系具有很好的男性特异性、组织同一性、种属特异性，可应用于法医学检验中，特别是对父系家族亲权鉴定的辅助检验、混合斑男性成分的检验、无名男尸的个人识别等法医学实践有非常积极的意义。对腐败检材的检测效果同样很好。同时由于Y-SNPs的特性，该体系在人类学研究方面，也有较好的前景。有些Y-SNPs成男性伴性遗传，可能与某些遗传性疾病的传递有关系，该体系有望用于遗传性疾病的研究。
参考文献
柯越海，宿兵，肖君华，等. Y染色体单倍型在中国汉族人群中的多态性分布与中国人群的起源及迁移[J]. 中国科学：C辑，2000，30(6)：614-620.
孟祥宁，薛雅丽，傅松滨. 利用Y染色体进行人类起源和进化分析 [J]. 国外医学：遗传学分册，2003，26(2)：63-66.
杜 宏，张 林，周 斌，等. 微测序技术检测12 个Y- SNPs 及其遗传多态性 [J]. 法医学杂志，2006，22(2)：125-129.
The Y Chromosome Consortium. A Nomenclature System for the Tree of Human Y-Chromosomal Binary Haplogroups [J]. Genome Res， 2002， 12(2)： 339-348.
Jobling MA， Tyler-Smith C. Fathers and sons： the Y chromosome and human evolution[J]. Trends Genet， 1995， 11(11)： 449-456.
Tatiana MK， Fernando LM， Monica BM， et al. New binary polymorphisms reshape and increase resolution of the human Y chromosomal haplogroup tree[J]. Genome Res， 2008， 18(9)： 830-838.
伍新尧，杨庆恩，刘 超，等. 法医物证学实验指导[M]. 北京：人民卫生出版社，2008：68-76.
Sanchez JJ， B?覬rsting C， Hallenberg C， et al. Multiplex PCR and minisequencing of SNPs： a model with 35 Y chromosome SNPs [J]. Forensic Sci Int， 2003， 137(1)： 74-84.
Inagaki S， Yamamoto Y， Doi Y， et al. Typing of Y chromosome single nucleotide polymorphisms in a Japanese population by a multiplexed single nucleotide primer extension reaction[J]. Leg Med (Tokyo)， 2002， 4(3)： 202-206.
Sanchez JJ， Phillips C， Bersting C， et al. A multiplex assay with 52 single nucleotide polymorphisms for human identification [J]. Electrophoresis， 2006， 27(8)： 1713-1724.
Onofri V， Alessandrini F， Turchi C， et al. Development of multiplex PCRs for evolutionary and forensic applications of 37 human Y chromosome SNPs[J]. Forensic Sci Int， 2006， 10， 157(1)： 23-35.
Brion M， Blanco-Verea A， Lareu V， et al. 29 Y-chromosome SNP analysis in European populations [C]. International Congress Series， 2004(8)： 73- 75.