作者：李巧巧， 刘孟忠， 王莉， 李锦清
【摘要】 【目的】 在人肝癌细胞中观察放射联合Sorafenib对细胞生长的作用，并探讨其作用途径。【方法】 选择人肝癌SMMC-7721和BEL-7402细胞株，分为单纯放射组(IR)、放射前30 min联合Sorafenib组(IR + S-pre)和放射24 h后联合Sorafenib组(IR + S-post)。细胞克隆形成实验检测照射后细胞克隆形成率，绘制细胞存活曲线并计算放射增敏比;细胞增殖抑制实验检测6 Gy照射后第1、2、3、4、5、6 d细胞增殖情况;免疫荧光染色观察照射后DNA损伤阳性细胞比例;流式细胞仪检测放射后细胞凋亡比例。【结果】 细胞克隆形成实验结果显示，IR + S-pre放射后细胞克隆形成增加，放射增敏比在SMMC-7721和BEL-7402细胞中分别为0.78和0.88;而IR + S-post放射后细胞克隆形成减少，放射增敏比在SMMC-7721和BEL-7402细胞中分别为1.43和1.23。细胞增殖抑制实验显示IR + S-pre与IR放射后细胞增殖抑制率相似，而IR + S-post放射后细胞增殖抑制率明显提高。 Sorafenib在SMMC-7721与BEL-7402中均有诱导细胞凋亡作用。IR + S-pre在放射后24 h细胞凋亡比例明显增高[IR vs IR + S-pre： (6.1 ± 1.0)% vs (18.3 ± 2.0)% (SMMC-7721)， (8.2 ± 2.1)% vs (17.0 ± 2.4)%(BEL-7402)，P &< 0.001]。IR + S-post在放射后48 h细胞凋亡比例明显增高，[IR vs IR + S-post分为(6.9 ± 2.0)% vs (15.9 ± 1.8)%(SMCC-7721)， (8.0 ± 1.5)% vs (14.2 ± 2.5)% (BEL-7402)，P &< 0.05]。放射后30 min，IR + S-pre与IR的DNA受损阳性细胞比例无明显差异。放射后6 h IR + S-pre的DNA受损阳性细胞残留比例明显下降[IR vs IR + S-pre： (59.9 ± 2.4)% vs (23.8 ± 2.9)%(SMMC-7721)，(46.4 ± 3.8)% vs (25.0 ± 3.0)%(BEL-7402)，P &< 0.001]。【结论】 放射联合Sorafenib对肝癌细胞作用具有明显时效性，放射24 h后联合Sorafenib增加放射引起的细胞克隆性生长抑制和增殖抑制，而放射前30 min联合Sorafenib 作用相反。
【关键词】 肝癌; 放射; 索拉非尼; 凋亡; DNA损伤修复
Abstract： 【Objective】 The effect of radiation combined with Sorafenib in hepatocellular carcinoma cells (HCC) and the mechanism of combination was investigated. 【Methods】 HCC lines SMMC-7721 and BEL-7402 were studied in 3 groups respectively： irradiation only (IR group)， radiation with Sorafneib 30 min pre-irradiaiton (IR + S-pre group) and radiation with Sorafenib 24 h post-irradiaiton (IR + S-post group). The cells were irradiated in different dose with or without Sorafenib. The different groups were compared according to the survival curves processed by clonogenic assay and the MTS assay in different days (1， 2， 3， 4， 5， and 6) after irradiated by 6 Gy. Then the tumor cells were irradiated by a dose of 6 Gy and their DNA damage after irradiation were determined respectively through γ-h3AX focus by immunoflurescence. The apoptosis cells were determined by flow cytometry. 【Result 】 The HCC cells had more colonies and similar proliferation inhibitor by IR + S-pre， and less colonies and higher proliferation inhibitor by IR + S-post compared with IR. The sensitivity enhance ratios (SERSF2) were 0.78 and 0.88 in IR 近年来，随着放射治疗技术的改进和精确放疗的出现，放射治疗在肝癌综合治疗中的应用日渐广泛。国内专家建议不能手术切除或手术后病灶残留的肝癌患者选择放射放射治疗[1]。但是，放射治疗作为局部治疗不能解决肝内播散和远处转移，影响肝癌放射治疗疗效。Sorafenib是目前证明治疗肝癌有效的唯一全身用药，早期在肠癌的研究发现其可以增加放射导致的肿瘤生长延迟[2]，但是缺乏在肝癌研究的数据。本研究在人肝癌细胞株中观察放射联合Sorafenib对细胞生长的作用，并探讨放射联合Sorafenib作用的途径。
1 材料与方法
1.1 细胞系及培养
人肝癌细胞株SMMC-7721和BEL-7402 由中山大学肿瘤防治中心中心实验室保存。培养液使用100 mL/L新生牛血清的RPMI1640完全培养液(内含100 u/mL青霉素和100 μg/mL链霉素)，置于37 ℃、体积分数5%CO2、湿度85%恒温培养箱培养，取指数生长期细胞进行实验。
1.2 实验材料
Sorafenib购自Bayer公司，DMSO溶解后以常规培养液稀释。终浓度为15 μmol/L的Sorafenib中，DMSO质量浓度为0.06%(下同)。
1.3 实验分组
对照组(Control)，单纯加入0.06% DMSO作用24 h;单纯放射组(IR)，除给予放射外，其处理与对照组相同;放射前30 min联合组(IR + S-pre)，放射前30 min加入终浓度15 μmol/L Sorafenib，作用24 h;放射24 h后联合组(IR + S-post)，放射24 h后加入15 μmol/L Sorafenib，作用24 h。
1.4 照射条件
使用钴60机，室温环境下照射，照射时表面覆盖1 cm有机玻璃板，等距离照射。
1.5 细胞克隆形成实验
取指数生长期细胞消化、悬浮、计数后，根据不同细胞株与不同照射剂量接种6孔板，每组3个平行处理孔。接种后培养12 h待细胞贴壁，按不同处理组要求加入DMSO或Sorafenib，分别照射0、2、4、6、8、10 Gy。培养10 d(SMMC-7721)或14 d(BEL-7402)后，弃去培养液，无水甲醇固定，结晶紫染色，显微镜下计数细胞数≥50个的克隆数。根据公式：克隆形成率(PE) = (集落数/细胞接种数) × 100%。存活分数(SF) = 细胞克隆数/(接种细胞数 × PE)，计算细胞存活分数并绘制细胞存活曲线。
1.6 细胞增殖抑制实验
取指数生长期细胞消化、悬浮、计数后，接种96孔板，每组3个平行处理孔。接种后培养24 h使细胞贴壁。按不同处理组要求加入DMSO和Sorafenib。分别用6 Gy照射，于照射后第1、2、3、4、5、6 d，每孔加入MTS/PMS混合溶液20 μL，37℃孵育60 min，自动酶标仪在490 nm波长处检测各孔存活细胞的吸光度A值。细胞增殖抑制率 = 1 - (A处理组 - A空白对照)/(A对照组 - A空白对照) × 100%。
1.7 DNA损伤细胞数测定
取指数生长期细胞，制成单细胞悬液，将细胞接种到预先放置盖玻片的6孔板，培养24 h后，按不同处理组处理细胞。照射后30 min、6 h和24 h，弃培养液。40 g/L多聚甲醛溶液固定，封闭后用一抗室温孵育2 h或4 ℃过夜。加入荧光二抗室温下孵育30 min，DAPI室温孵育5 min。荧光共聚焦显微镜(日本Olympus，10 × 40及10 × 100)下测定γ-h3AX荧光表达，用pImageTool软件计算DNA损伤阳性细胞数(核内γ-h3AX焦点 &> 10[3])，每张玻片至少计算200个细胞，每个处理组实验重复3次，计算平均值及标准差。
1.8 流式细胞仪检测细胞凋亡率
取指数生长期细胞，制成单细胞悬液，按细胞种类接种于6孔板内，培养24 h后，按不同处理组处理细胞，照射后继续培养24 h或48 h。收集细胞，按试剂盒的说明进行Annxin V-FITC和PI标记后立即检测细胞凋亡率。每个处理组实验重复3次。
1.9 统计方法
采用单击多靶数学模型[S = 1-(1-eD/D0)n]拟合细胞生存曲线，计算平均致死剂量(D0)、照射2 Gy的存活分数比(SF2)，由SF2比表示的放射增敏比(SERSF2 = 对照组SF2/放射联合Sorafneib处理组SF2)。采用SPSS 11.0软件，计量资料组间差别使用Sdudent?蒺s t test进行统计分析，检验水准α = 0.05。
2 结 果
2.1 放射联合Sorafenib在肝癌细胞内显示不同时效作用
2.1.1 放射后细胞生存曲线
显示IR + S-pre较IR照射后后细胞存活增加，放射增敏比(SERSF2)小于1;而IR + S-pos结果相反：人肝癌细胞SMMC-7721 的克隆形成率IR、IR + S-pre、IR + S-post分别为(50.1 ± 2.2)%、(43.8 ± 2.6)%、(40.9 ± 2.9)%;人肝癌细胞BEL-7402 IR的克隆形成率IR、IR + S-pre、IR + S-post分别为(80.3 ± 3.4)%、(58.5 ± 1.8)%、(58.8 ± 3.2)%。放射后细胞实际存活曲线见图1(每组处理重复3次)，按单击多靶数学模型转换后细胞存活曲线见图2，计算的相应参数见表1。SF2表示2 Gy照射后细胞存活率，能较好的反应放射敏感性[4]，SERSF2表示2 Gy照射的细胞增敏比。
2.1.2 放射后细胞增殖抑制曲线
显示随时间推移，IR + S-post明显增加放射引起的肝癌细胞增殖抑制作用，而IR + S-pre对肝癌细胞增殖抑制影响较小、影响时间较短：用MTS检测不同处理的SMMC-7721和BEl-7402细胞放射后第1、2、3、4、5、6 d的细胞增值抑制率(图3，每组处理重复3次的平均值)。
2.2 细胞凋亡检测
发现Sorafenib可以增加肝癌细胞凋亡比例，但无延迟效应：单纯使用Sorafenib作用24 h，在SMMC-7721中细胞凋亡率为(18.3 ± 2.9)%，对照组(3.4 ± 2.2)%(P = 0.003);在BEL-7402中细胞凋亡率为(14.3 ± 1.6)%，对照组(7.2 ± 1.3)% (P = 0.005)。撤除Sorafenib，换无药培养液继续培养，SMMC-7721细胞24 h后凋亡率恢复至未处理水平，而BEL-7402细胞48 h后恢复至未处理水平。放射与Sorafenib联合处理后细胞凋亡比例见表2，与单纯Sorafenib处理类似，药物作用时出现细胞凋亡比例升高。
2.3 免疫荧光检测
免疫荧光检测6 Gy放射后不同时间肝癌细胞株SMMC-7721和BEL-7402细胞内γ-h3AX蛋白聚焦点，细胞内γ-h3AX聚焦点 &> 10个的细胞定义为DNA受损伤的阳性细胞[3]，发现Sorafenib增加放射后DNA损伤修复，而对DNA损伤无影响：放射后不同时间DNA受损阳性细胞比例见表3、图4。IR + S-pre的肝癌细胞，放射后短时间内DNA受损伤阳性细胞比例与IR的肝癌细胞无明显差异，Sorafenib对放射后的DNA损伤无影响。放射后较长时间检测，IR + S-pre残留的DNA受损伤阳性细胞比例较IR明显减少，Sorafenib增加了放射后DNA损伤的修复。另一方面，肝癌细胞放射后24 h，DNA受损伤阳性细胞基本消失，IR + S-post与IR照射后DNA受损伤阳性细胞比例无显著差异。
3 讨 论
3.1 放射后联合Sorafenib增加放射的作用，放射前联合作用相反
通过观察放射联合Sorafenib对肝癌细胞的作用，我们发现联合作用的效应与加入Sorafenib的时间密切相关，放射前30 min联合Sorafenib降低了放射对肝癌细胞的克隆性细胞生长抑制和增殖抑制作用，而放射24 h后联合Sorefnib则增加了放射的上述作用。这与早期报道的研究结果相似。Wilson等[4]比较了放射不同时间联合Sorafneib对肠癌和胰腺癌细胞的作用，包括放射前长时间间隔、放射前短时间间隔、放射后立即和放射后短时间间隔加药，发现只有放射后加入Sorafenib可以增加放射导致的克隆性细胞生长抑制和增殖抑制。另外，Plastars等[2]的裸鼠肠癌移植瘤模型实验中也发现，放射同时联合Sorafenib与单纯放射比较差异不大，放射后联合则明显增加放射引起的肿瘤生长抑制。根据以上和本研究的实验结果，我们认为放射联合Sorafenib的作用具有明显的时效差异。
3.2 Sorafenib诱导的肝细胞凋亡不是不同时效作用的主要原因
为探讨这种时效差异产生的原因，我们首先观察了两种肝癌细胞经过放射和放射不同时间联合Sorafenib处理后细胞的增殖抑制状态。我们发现，IR + S-post处理的两种细胞增殖抑制率的提升均明显高于单纯放射，并且随时间推移差异加大;而IR + S-pre处理的两种细放射后的增殖抑制与单纯放射基本相似。放射后细胞死亡的主要形式包括：凋亡、坏死、自噬和有丝分裂失败。早期的研究发现，Sorafenib可以诱导肝癌细胞凋亡[5]，那么放射不同时间联合Sorafenib对肝癌细胞增殖抑制的差异是否由于凋亡引起?我们进一步观察各种处理后细胞的凋亡比例。结果发现，Sorafenib对SMMC-7721和BEL-7402细胞均有诱导凋亡的作用，但是去除Sorafnib后细胞凋亡比例在短时间内恢复，单独使用Sorafenib或放射不同联合Sorafenib的结果均相似。因此，我们认为Sorafenib没有延迟的诱导凋亡作用，诱导肝癌细胞凋亡不是导致放射联合Sorafenib不同时效作用的主要原因。
3.3 Sorafenib增加放射后DNA损伤修复可能导致不同时效作用
有丝分裂失败也是射线致细胞死亡的主要原因，常发生在放射后较长时间内，细胞死亡前试图通过几次有丝分裂[6]，最终导致细胞的继发性死亡，如凋亡、自噬或坏死等。有丝分裂失败是引起放射后细胞增殖抑制持续增高的主要原因， 放射不同时间联合Sorafenib引起放疗后不同的细胞增殖抑制率改变是否与有丝分裂失败相关?由于有丝分裂失败发生的主要原因是放射后DNA损伤未完全修复而进入有丝分裂。接下来，我们通过免疫荧光观察放射后肝癌细胞内γ-h3AX的聚焦点，了解放射联合Sorafneib对放射后肝细胞DNA损伤与修复的影响。
h3AX是组蛋白h3A家族的一员，DSBs发生后，h3AX磷酸化形成γ-h3AX，最终修复DNA[8]。实验证明，在DSBs处产生的γ-h3AX磷酸化形式，是检验DSBs的金标准[9-10]。采用免疫荧光技术观察到的DSBs处γ-h3AX的聚焦点的数量与DSBs数量之间成线性正相关[11]。γ-h3AX的聚焦点不仅可以反应放射后细胞内DNA损伤状态，还可以反应细胞内DNA修复状态，放射一段时间后细胞内残存的γ-h3AX数量可以代表未被修复的DSBs数量[12-13]。本研究发现，IR + S-pre对放射后30 min两种细胞的DNA受损阳性细胞比例均无明显影响，认为加入Sorafenib不影响放射后细胞DNA 损伤。而IR + S-pre减少了放射后6 h细胞内γ-h3AX的残留，增加放射后细胞DNA损伤的修复，导致细胞在以后的增殖中出现有丝分裂失败的几率减少，细胞增殖抑制率增加减缓，与放射后细胞增殖抑制状态观察的结果吻合。另一方面，我们发现肝癌细胞受照射后24 h内DNA修复基本完成，放射后24 h DNA受损阳性细胞比例在两种细胞中均小于5%。因此，我们推断IR + S-post不影响放射后细胞的DNA损伤与修复，这也解释了经过放射24 h后Sorafenib处理的肝癌细胞出现与单纯放射相似，放射后持续增高的增殖抑制状态。
本研究为体内实验，提示进一步的体内实验和临床研究必须注意放射与Sorafenib联合使用不同时效作用，作用机理与Sorafenib影响放射后DNA修复有关，而与Sorafenib诱导细胞凋亡关系不大。放射前Sorafenib，由于增加了放射后肝癌细胞DNA损伤修复，减少放射后有丝分裂失败几率，抵消了由于加入Sorafenib引起的放射后细胞凋亡比例增加，最终不增加放射引起的细胞克隆性生长和增殖抑制作用;而放射24 h后联合Sorafenib，由于错过放射后DNA损伤修复发生时间，不影响放射后DNA修复，同时Sorafenib增加了放射后细胞凋亡比例，最终增加了放射引起的细胞克隆性生长和增殖抑制作用。另外，放射与Sorafenib联合作用的时间也有可能影响最终的结果。本研究使用Sorafenib的时间较短，诱导凋亡对肝癌细胞的影响较少，进一步实验可以考虑延长作用时间。
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