作者：操隆辉 周建华 林文前 谭红鹰 曾维安 曾益新
【摘要】 【目的】 以人鼻咽癌CNE-2细胞裸鼠移植瘤为模型，探讨吗啡对顺铂抑制肿瘤生长作用的影响及其机制。【方法】 建立CNE-2细胞裸鼠移植瘤模型20只，随机分为4组，对照组，单纯顺铂用药组、单纯吗啡用药组和吗啡联合顺铂用药组，每组5只。吗啡5 mg/kg每天给药1次，顺铂3 mg/kg每3 d给药2次，均为腹腔注射。用药14 d后处死动物，完整剥离肿瘤，记净瘤质量。TUNEL染色计算细胞凋亡数，免疫组化染色检测肿瘤组织Bax，Bcl-2，cleaved-caspase-3以及CD34的表达情况。【结果】 单纯顺铂用药组的瘤质量明显小于其它3组(P &< 0.05)，吗啡联合顺铂用药组的瘤质量明显小于对照组(P &< 0.05);TUNEL染色及cleaved-caspase-3染色显示单纯顺铂用药组的凋亡细胞数明显多于其他3组(P &< 0.05)。单纯顺铂用药组与其他3组相比Bax蛋白表达量增多，而Bcl-2表达量减少，单纯吗啡组的Bcl-2表达最强。CD34微血管染色显示单纯顺铂用药组的微血管密度显著少于其它3组(P &< 0.05)，单纯吗啡用药组的微血管密度显著多于对照组(P &< 0.05)。【结论】 吗啡通过拮抗顺铂诱导细胞凋亡及促进CNE-2细胞裸鼠移植瘤组织的血管生成，抵抗了顺铂抑制肿瘤生长的作用。
【关键词】 吗啡; 顺铂; 凋亡; CNE-2细胞
Abstract： 【Objective】 To evaluate the effect of morphine(Mor) on the suppression of cisplatin on tumor growth of human nasopharyngeal carcinoma CNE-2 xenografts in nude mice and possible mechanisms. 【Methods】 Twenty BALB/C nude mice were pided into 4 groups randomly including control group (0.01 mL/g saline was given every day)， CDDP alone group (3 mg/kg twice every 3 days)， Mor alone group (5 mg/kg once daily) and the combination of Mor (5 mg/kg once daily) and CDDP (3 mg/kg once every 2 days). The procedure lasted 14 days after beginning to give drugs. At the end points， mice were euthanized and tumor weights were recorded. TUNEL staining of CNE-2 xenograft tumor sections was used for detecting apoptosis cell. CD34， cleaved-caspase-3， Bcl-2 and Bax immunohistologic staining of the same tumor sections were also observed. 【Results】 The tumor weight of CDDP group was the smallest in all groups (P &< 0.05). The tumor weight of the Mor and CDDP combination group was smaller than that of the control group. The number of TUNEL-positive and cleaved-caspase-3-positive cells of CDDP group were the most in all group (P &< 0.05). Compared with the other groups including the Mor and CDDP combination group， the protein Bax of CDDP group was expressed the highest level， whereas the level of Bcl-2 was the lowest. The level of of Bcl-2 of Mor group was the highest in all group. The expression of CD31 decreased after CDDP treatment， but increased after morphine treatment. 【Conclusion】 Morphine inhibited the suppression of cisplatin on tumor growth through inhibiting cisplatin-induced apoptosis and promoting angiogenesis of human CNE-2 xenografts in nude mice.
吗啡在中枢神经系统通过特定的受体发挥止痛作用，常在临床上用于癌痛的治疗。近年来，随着人们对细胞凋亡在疾病发生发展中机制的进一步认识，阿片类药物对细胞凋亡的调节作用亦有了深入不断地研究。已有许多相关研究证实不同剂量的吗啡对不同的细胞株发挥着或促生长或促凋亡的作用[1]。那么应用化疗药物的肿瘤治疗过程中，吗啡是否仍然具有这些作用以及这些作用是否会对肿瘤化疗效果产生影响也成为关注的焦点。本研究旨在以人鼻咽癌CNE-2细胞裸鼠移植瘤为模型来初步探讨吗啡对对顺铂抑制肿瘤生长作用的影响及其可能的机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
吗啡(morphine， Mor，沈阳第一制药厂);顺铂(cisplatin， CDDP，Mayne Pharma Pty Ltd.公司，澳洲);Bax抗体(Santa Cruz公司，美国);Bcl-2抗体(Santa Cruz公司，美国);Cleaved-caspase-3抗体(Cell Signaling Technology公司，美国)，CD34抗体(Abcam公司，英国)。非生物素二步法PV-9000试剂盒(GBI公司，美国);DAB试剂盒(DAKO公司，丹麦);TUNEL Assay Kit 试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司);病理切片测量系统为Leica AS LMD激光显微切割系统(德国)。
1.2 模型建立和动物分组
BALB/C 裸鼠(SPF)级，雌性，4周龄，体质量15 ～ 20 g，平均16.56 g，购于广东省动物实验中心(动物合格证号：21060078)。共20只，随机分为4组：对照组(A组)，单纯顺铂用药组(B组)，单纯吗啡用药组(C组)，吗啡联合顺铂用药组(D组)。人鼻咽癌细胞株CNE-2由中山大学肿瘤防治中心实验研究部提供，调整其细胞浓度为1 × 107/mL，0.2 mL皮下接种于裸鼠腋下，接种细胞后的第3天开始药物干预。A组(对照组)每天给予生理盐水(0.01 mL/g)腹腔注射;B组(单纯顺铂用药组CDDP)给予顺铂(3 mg/kg)腹腔注射(0.01 mL/g)，每连续给药2 d间隔1 d;C组(单纯吗啡用药组Mor)每天给予吗啡(5 mg/kg)腹腔注射(0.01 mL/g);D组(吗啡联合顺铂用药组CDDP + Mor)给予顺铂(3 mg/kg)和吗啡(5 mg/kg)腹腔注射(0.01 mL/g)，其中顺铂每连续给药2 d间隔1 d，吗啡则每天给药1次，连续14 d。
1.3 观察指标
由皮下接种肿瘤开始，隔天测量肿瘤的体积大小、裸鼠体重，观察裸鼠有无恶液质的出现。14 d后结束实验，颈椎断颈法处死所有裸鼠，完整切除肿瘤，测量肿瘤质量后常规40 g/L多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，选择最大横切面5 μm切片，常规HE染色，观察镜下肿瘤组织的病理特点。
1.4 TUNEL染色
石蜡切片常规脱蜡、水化，30 mL/L h3O2封闭30 min，20 mg/L 蛋白酶K消化液20 min，加TUNEL反应液，37 ℃孵育60 min，过氧化物酶连接的抗荧光素抗体，37 ℃孵育30 min，PBS洗5 min × 3 次，DAB显色，苏木素复染，脱水透明，封片。以PBS替代TUNEL反应液作阴性对照，TUNEL阳性标准为：细胞核内呈棕黄色[2]。高倍镜下，随机取5个不同的视野，由两位不知情者计数凋亡细胞数，取其平均值作为该样本的凋亡细胞数。
1.5 免疫组化
石蜡切片常规脱蜡、水化，h3O2 10 min阻断内源性过氧化酶，枸橼酸缓冲液高温抗原修复，滴加一抗稀释液约50 μL， 4 ℃孵育过夜，PBS洗涤，滴加二抗，于37 ℃孵育30 min，PBS洗涤，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片，显微镜下观察。所有样本由两位熟练的病理科主治医师单独阅片，取其平均值作为该样本的最终结果。Bax，Bcl-2结果判定采用综合评分法，在高倍光镜下对阳性细胞进行评分，随机选择5个视野，总共计数200个细胞，没有细胞着色为0分，≤20%细胞着色为1分，21% ～ 50%细胞着色为2分， &> 50%细胞着色为3分。阳性染色强度按以下标准区分：没有着色为0分，微弱棕黄色为1分，核或浆中等强度棕黄色为2分，阳性细胞核或浆呈深棕色为3分。最后将上述两种评分相乘之积作为评判标准，分数为0 ～ 2分者作为阴性，3 ～ 6分阳性表达，6分以上为强阳性表达。Cleaved-caspase-3结果判定为胞浆或胞核被染成棕色或棕褐色的为阳性结果[3]。高倍镜下，随机取5个不同的视野记录着色细胞数，取平均值。CD34结果判定
参考文献
方法[4]，先在低倍镜( × 10)下观察整个切片，寻找肿瘤内血管密度最高处，即“热点”，然后在高倍镜下( × 40)计数被染色的血管数目，记录3个视野内的微血管数，取其平均值为微血管密度。1.6 统计方法
所有数据统计均采用SPSS 13.0统计软件包进行分析处理，所有计量资料以均数 ± 标准差(x ± s)表示，多组样本均数的比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD法。P &< 0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 动物一般情况和瘤质量
在给药14 d后，对照组肿瘤平均体积大于1 cm3结束实验。治疗过程中无裸鼠死亡，给药过程中未观察到明显的裸鼠进食、活动减少，皮疹、腹泻、脱皮等不良反应。用药结束后，对照组、单纯顺铂组、单纯吗啡组和二者联合组裸鼠净瘤质量(g)分别为：1.05 ± 0.36、0.35 ± 0.16、1.04 ± 0.23、0.69 ± 0.14，单纯顺铂用药组和吗啡联合顺铂用药组的净瘤质量显著小于对照组(P &< 0.05)，单纯吗啡用药组的净瘤质量与对照组之间的差异没有统计学意义(P &> 0.05)，而吗啡联合顺铂组的净瘤质量也显著大于单纯顺铂用药组(P &< 0.05)。
2.2 TUNEL染色结果
单纯顺铂用药组的瘤组织内可见较多的胞核内呈棕黄色，而胞浆呈空泡状，这说明瘤细胞的胞核出现凋亡的特征(图1)，凋亡的细胞数量显著多于对照组、单纯吗啡用药组 (P &< 0.05);而吗啡联合顺铂用药组与单纯顺铂用药组相比，凋亡细胞数量显著减少(P &< 0.05)。对照组与单纯吗啡用药组凋亡细胞数没有明显差异(P &> 0.05，表1)。
2.3 免疫组化结果
单纯顺铂用药组的cleaved-caspase-3表达最多，明显多于对照组(P &< 0.05)、单纯吗啡组(P &< 0.05)和吗啡联合顺铂用药组(P &< 0.05);联合用药组的表达也较对照组明显增多(P &< 0.05，表1)。单纯顺铂用药组的Bcl-2蛋白表达明显较弱(阴性 ～ 阳性)，而对照组和吗啡联合顺铂用药组Bcl-2的表达明显强于单纯顺铂用药组(阳性 ～ 强阳性)，单纯吗啡组的Bcl-2表达最强，均为强阳性表达。Bax蛋白的表达在单纯顺铂用药组最强，均为强阳性，其它各组表达均为阴性 ～ 阳性。CD34染色结果显示;与对照组相比，单纯顺铂用药组显著抑制了CNE-2肿瘤组织内的血管生成(P &< 0.05)，而单纯吗啡组的微血管密度显著高于对照组(P &< 0.05)，联合用药组的微血管密度显著高于单纯顺铂用药组(P &< 0.05;图1)。
3 讨 论
3.1 顺铂抑制肿瘤生长的机制
顺铂是一种细胞周期非特异性抗肿瘤药物，它通过与DNA链结合，形成交叉联接，抑制DNA和RNA合成和细胞有丝分裂，从而抑制肿瘤生长，该药已用于多种实体肿瘤的治疗，是目前较为有效的化疗药物之一。Cheung等[5]已在体外实验中证实顺铂诱导鼻咽癌CNE?鄄2细胞株发生凋亡，与磷酸化Bcl-2和上调Bax表达水平密切相关。在本实验中，证实了顺铂明显抑制了CNE-2细胞裸鼠移植瘤的生长，并且通过TUNEL实验和cleaved-caspase-3免疫组化染色证实顺铂在体内诱导了瘤组织内细胞的凋亡。同时肿瘤组织免疫组化也发现顺铂组Bcl-2表达减少，Bax表达增多，提示Bcl-2/Bax的改变在顺铂诱导瘤组织内细胞的凋亡，抑制CNE-2细胞裸鼠移植瘤的生长发挥了重要的作用。而顺铂3 mg/kg的剂量也明显抑制了CNE-2细胞裸鼠移植瘤内的血管生成。这一结果与王延涛等[6]研究相符，正如Emmenegger等[7]研究发现一些传统的细胞毒化疗药在采用小剂量、长时间连续或高频率(如每周1 ～ 3次)的给药模式下，可选择性地显著抑制肿瘤血管生成。
3.2 吗啡拮抗顺铂诱导的瘤组织内细胞凋亡
本研究中吗啡联合顺铂用药组的肿瘤的净质量明显高于顺铂组，提示吗啡可能拮抗了顺铂抑制肿瘤生长的作用。而TUNEL实验和cleaved-caspase-3免疫组化染色也证实吗啡联合顺铂用药组的瘤组织内凋亡细胞数较顺铂组明显减少。肿瘤组织免疫组化也发现与顺铂组相比，吗啡联合顺铂用药组Bcl-2表达增多，Bax表达减少。提示吗啡拮抗了顺铂体内诱导CNE-2细胞裸鼠移植瘤组织内细胞凋亡的作用。许多研究显示Bcl-2可以延长细胞的存活期，抑制多种刺激引起的凋亡。而Bax能够拮抗Bcl-2的凋亡抑制作用。在凋亡中Bcl-2蛋白表达降低而Bax蛋白表达增加，Bcl-2/Bax的蛋白比值也是决定细胞命运的一个重要指标[8]。过度表达Bcl-2抑制细胞凋亡增加了细胞对化疗与放疗的抵抗[9]。Yin等[10]研究发现在鼻咽癌CNE-1细胞株通过RNA干扰技术抑制Bcl-2基因，增加了其对化疗的敏感性。Eliopoulous等[11]在研究卵巢癌耐药和凋亡调控时发现Bcl-2高表达是卵巢癌细胞耐药的重要原因。也就是说，凋亡途径的异常是肿瘤细胞产生耐药的重要机制。这些研究都与本实验结果相一致。吗啡增加了CNE-2细胞裸鼠移植瘤内的Bcl-2蛋白的表达，改变Bcl-2/Bax的比率，抑制了细胞对顺铂化疗的敏感性。
3.3 吗啡促血管生成的作用
在本研究中发现吗啡5 mg/kg单独应用具有促进CNE-2细胞裸鼠移植瘤组织内血管生成的作用，也拮抗了顺铂3 mg/kg抑制血管生成的作用。Gupta等[12]在体外实验证实了低剂量即临床相关剂量的吗啡促进血管内皮细胞的增殖，同时也在体内实验证实了长期低剂量的给予吗啡可以通过促进肿瘤新生血管的生成而促进乳腺癌肿瘤的增长。但是在他们的实验中，吗啡在用药28 d后，肿瘤的体积才有显著性的增长，而初始阶段与对照组并无明显差异，他们认为这是因为在肿瘤开始生长的阶段，血管生成的影响非常小[12]。这也与本实验结果一致。在本研究中吗啡没有明显促进肿瘤的生长，但是CD34免疫组化染色却显示出了其促血管生成的作用。所以在吗啡对顺铂抑制CNE-2细胞裸鼠移植瘤生长的影响的研究中，不可忽视其促肿瘤血管生成的作用。在顺铂抑制CNE-2细胞裸鼠移植瘤生长这个过程中，吗啡既抑制了顺铂诱导的细胞凋亡又促进肿瘤血管生成而拮抗顺铂抗血管生成的作用，至于哪一方面起主导作用，可能和药物剂量、作用时间、甚至肿瘤细胞的类型有关。
3.4 总 结
综上所述，在CNE-2细胞裸鼠移植瘤模型中，吗啡抑制了顺铂诱导的细胞凋亡和拮抗了顺铂的抗血管生成的作用，因此，在吗啡的临床应用中，可能会影响顺铂的化疗效果，也有可能会影响其他一些作用机制类似的化疗药物的作用。那么在癌症患者疼痛治疗受到越来越多关注的今天，吗啡的临床应用应该引起更多的关注与思考。
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