作者：祝丽琼 陈慧 杜碧君 谭剑平 刘颖琳 王蕴慧 张睿 张建平
【摘要】 【目的】 探讨血栓前状态分子标志物：凝血酶原片段F1+2(F1+2)、凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物(TAT)、抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)、D-二聚体(D-Dimer)与早期复发性流产(RSA)的关系，及各分子标志物对血栓前状态(PTS)引起的RSA的诊断价值。【方法】 比较103例RSA已孕者(AEP组)、103例有RSA病史现未孕者(ANP组)及40例正常早孕者(NEP组)及40例健康未孕者(NNP组)血清中F1+2、TAT、AT-Ⅲ、D-Dimer水平;并以ROC曲线方法判断PTS引起的RSA发生时以上各个指标的最佳临界值。【结果】 1. ANP组血浆F1+2、D-Dimer水平显著高于NNP组，两者间差异有显著性(P &< 0.008);而且流产3次者较2次者指标水平高，差别有统计学意义(P &< 0.016 7)。F1+2 与D-Dimer判断RSA未孕患者存在血栓前状态的最佳筛查界值分别为55.11 nmol/L(AUC = 0.767)及233.50 μg/ L (AUC = 0.636)。2. ANP组血浆TAT水平高于NNP组，AT-Ⅲ水平低于NNP组，但其差别无统计学意义(P &> 0.008)。AEP组血浆F1+2、TAT、D-Dimer水平高于NEP组，AT-Ⅲ水平低于NEP组，但其差别无统计学意义(P &> 0.008)。【结论】 RSA与PTS存在相关性;RSA患者在孕前已经表现为PTS，PTS的标志物F1+2、D-Dimer可用于RSA未孕人群流产原因的筛查，其水平越高，流产可能性越大。
【关键词】 复发性流产; 血栓前状态; F1+2; TAT; AT-Ⅲ; D-Dimer
Abstract： 【Objective】 To investigate the relationship between F1+2， TAT， AT-Ⅲ， D-Dimer and recurrent spontaneous abortion. Then to investigate the diagnostic value of each maker of Thrombophilia to RSA . 【Methods】 To compare the serum concentrations of F1+2， TAT， AT-Ⅲ and D-Dimer in 103 early pregnant women with RSA (AEP group) and 103 non-pregnant women but had RSA history (ANP group) and 40 normal early pregnant women (NEP group) and 40 normal non-pregnant women (NNP group). Receiver Operating Characteristic curve was used for the critical value. 【Result】 (1) In ANP group， the levels of F1+2 and D-Dimer were significantly higher than those in NNP group. There were obvious statistical difference (P &< 0.008). Meanwhile， the levels of F1+2 and D-Dimer were higher in 3 times abortion than in 2 times abortion. There were obvious statistical difference (P &< 0.0167). ROC curve analysis revealed that the optimal critical value of F1+2 for predicting abortion was 55.11 while D-Dimer was 233.50 μg/ L. The area under curve (AUC) were 0.767 and 0.636. (2) The levels of TAT in ANP group were higher than those in NNP group. The levels of AT-Ⅲ in ANP group were lower than those in NNP group. But there were no statistical difference (P &>0.008). In AEP group ， the levels of F1+2， TAT， and D-Dimer were higher than those in NEP group， the levels of AT-Ⅲ were lower than those in NEP group. But there were no statistical difference (P &> 0.008). 复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion， RSA)原因十分复杂，除内分泌因素、遗传因素，免疫因素，感染因素及生殖器畸形等病因外，仍有一半以上RSA病因不明。近年来，血栓前状态(prethrombotic state， PTS)与不明原因复发性流产(URSA)的关系日益引起国内外学者的关注[1-2]。有资料显示：RSA病人底蜕膜、胎盘绒毛及脐带血管内血栓形成，经抗凝治疗后部分患者能获得正常妊娠[3]。因此，国内外许多学者提出了对有复发性流产的患者增加实验室诊断血栓前状态指标的筛查，异常者并尽早预防治疗，以防流产的发生。但目前国内外尚无明确的初筛和诊断围生期孕产妇血栓前状态的实验室诊断指标。本研究希望通过联合检测凝血、抗凝及纤溶指标，即检测复发性流产患者及正常妊娠妇女凝血相关因子(F1+2)、抗凝血因子(AT-Ⅲ、TAT)及纤溶相关因子(D-Dimer)在血浆中的变化，以探讨RSA患者中血栓前状态分子标志物的变化规律，寻找RSA血栓前状态早期诊断的实验室诊断指标。
1 材料与方法
1.1 研究对象
随机收集2007年6月至2007年12月在中山二院不孕不育专科门诊就诊的早期复发性流产未孕者103例(ANP组)及收住在中山二院产前区安胎的早期复发性流产早孕者103例(AEP组)分别为两病例组，年龄22 ～ 34岁，平均29.34(S = 3.14)岁，以往自然流产次数2 ～ 6次。患者均进行流产原因检查：经夫妇外周血染色体检查排除遗传因素、患者阴道分泌物检查及血液Torch检查排除感染因素、性激素检查排除内分泌因素、B超及宫腔镜检查排除生殖器官解剖异常(其中宫腔镜检查为有创性检查，需签具检查同意书)。随机收集同期在中山二院体检中心进行健康体检者40例(NNP组)及B超确诊宫内早孕，在门诊行无痛人流的早孕者40例(NEP组)，作为两个对照组，年龄20 ～ 34岁，平均28.34(S = 2.34)岁，以往无自然流产病史。所有研究对象均无糖尿病、肾脏疾病、甲状腺疾病等内科疾病史，近两个月未使用抗凝或促纤溶药物，未孕者均未服用避孕药物。
1.2 方 法
1.2.1 标本收集
抽取外周静脉血，用0.11 mol/L枸橼酸钠抗凝，静脉血与抗凝剂比例为9：1，立即摇匀，1 500 × g离心10 min，收集上层血浆尽快进行F1+2、 AT-Ⅲ、TAT、D-Dimer检测。
1.2.2 试剂和主要仪器
F1+2、AT-Ⅲ、TAT的试剂盒购于上海西唐科技有限公司，使用宝特酶标仪ELX-800，以ELASA方法检测;D-Dimer 的试剂盒购于德国DADE BEHRING，使用SysmexCA-1500全自动凝血仪，以免疫比浊法检测。
1.3 统计方法
采用SPSS 11.0统计学软件进行统计分析。因为计量资料不符合正态分布，因此结果采用中位数表示，两组间的比较采用Z检验，依Bonferroni法调整α值为0.008。诊断临界值采用ROC(Receiver Operating Characteristic curve)曲线分析。不同流产次数的3组比较用?字2检验，如有意义则进行两两比较，依Bonferroni法调整?琢为0.0167。
2 结 果
2.1 ANP组与NNP组各指标的对比
ANP组F1+2、D-Dimer水平显著高于NNP组，两者间差异有显著性(P &< 0.008);ANP组TAT水平高于NNP组，AT-Ⅲ 水平低于NNP组，但其差别无统计学意义(P &> 0.008;表1)。
2.1.1 不同流产次数F1+2的对比
随着流产次数增多，血液中F1+2水平升高，3组差异有统计学意义(P &< 0.0167)。再进行两两比较，发现流产3次者F1+2水平高于流产2次者，差别有统计学意义(P &< 0.0167)。流产4次者高于流产3次以上者，差别无统计学意义(P &> 0.0167;表2、3)。
2.1.2 不同流产次数D-Dimer的对比 随着流产次数增多，血液中D-Dimer水平升高，3组差异有统计学意义(P &< 0.0167)。再进行两两比较，发现流产3次者D-Dimer水平高于流产2次者，差别有统计学意义(P &< 0.0167)，流产4次者高于流产3次以上者，差别无统计学意义(P &> 0.0167;表4、5)。
2.2 AEP组与NEP组各指标的对比
AEP组F1+2、TAT、D-Dimer水平高于NEP组，AT-Ⅲ 水平低于NEP组，但其差别无统计学意义(P &> 0.008;表6)。
2.3 F1+2最佳筛查界值的判定
F1+2 判断RSA未孕患者存在血栓前状态的最佳筛查界值为55.11 nmol/L，其ROC曲线下面积(AUC)为0.767，其灵敏度为89.4%，特异度为65.8%(图1)。
2.4 D-Dimer最佳筛查界值的判定
D-Dimer判断RSA未孕患者存在血栓前状态的最佳筛查界值为 233.50 μg/ L。其ROC曲线下面积(AUC)为0.636，其灵敏度为39%，特异度为86%(图2)。
3 讨 论
凝血、抗凝、纤溶既是相互对抗又相互依存的复杂体系，正常情况下维持动态平衡。如各种因素引起了凝血因子含量增高或被活化和抗凝因子含量减少或结构异常，会导致凝血和抗凝机制紊乱，使得机体存在血液高凝状态，继而发生继发性的纤溶亢进。凝血、抗凝及纤溶指标的单独检测不能全面反映高凝状态。因此，联合检测凝血、抗凝及纤溶指标才具有更大的临床意义。
在凝血过程中，凝血酶原在因子Xa(FXa)作用下在其氨基端273精氨酸和274位苏氨酸处肽键断裂，凝血酶原氨基端释放出凝血酶原片段PF1+2(ProthrombinFragmentl+2)，简称F1+2，形成前凝血酶2，后者在FXa作用下，其322位精氨酸与323位异亮氨酸间肽键切断形成凝血酶，此时表现出F1+2水平升高，它是凝血酶原激活的特异分子标志物 ，由此可认为它是体内处于高凝状态较灵敏的早期分子标志物，且作为血栓前状态及血栓病诊断的重要意义已受到广泛关注。国内外诸多学者研究资料表明F1+2在深静脉血栓、心、脑血管疾病等血栓前状态的诊断以及抗凝治疗的监测均具有重要意义。徐成伟等[4]学者研究发现：正常晚孕组及妊高征各组F1+2含量均明显高于未孕组，差异有统计学意义;且随病情加重，F1+2含量有升高趋势，提示凝血酶过度激活、凝血功能增强是形成血栓前状态的重要原因。本实验结果表明：复发性流产未孕妇女F1+2水平较正常未孕妇女高(中位数141.32 nmol/L vs 39.46 nmol/L)，差别有统计学意义(P &< 0.008)。而且流产3次者较2次者指标水平高，差别有统计学意义(P &< 0.0167)，表明：F1+2可作为复发性流产未孕人群是否存在血栓前状态的筛查指标，其最佳筛查界值为55.11 nmol/L(AUC = 0.767)。随着流产次数增加，该指标上升。流产4次者较流产3次以上者水平稍高，但差别无统计学意义(P &> 0.0167)。流产3次和4次以上没有差异的原因，可能实际上两组没有差异，即该指标上升到一定水平后上升程度减弱或甚至停止。也可能是因为样本量太小，差别未能显示统计学意义。
在正常情况下，AT-Ⅲ与肝素结合后抑制凝血酶、纤溶酶及多种凝血因子的活性，维持血凝平衡，是防止血栓形成的重要生理物质。血栓前状态时，由于血管内皮损伤，使内皮细胞破坏，局部释放AT-Ⅲ减少，同时由于损伤的内皮细胞激活内、外源性凝血途径，使凝血酶大量生成，也消耗了大量的AT-Ⅲ，使其水平显著降低，致使内皮细胞的抗血栓功能减弱。近年来，研究表明抗凝血酶缺陷所致的血栓形成倾向与不良妊娠有关，认为AT-Ⅲ缺陷与妊娠丢失可能存在关联[5-7]。AT-Ⅲ的活性在妊娠期间没有明显改变，但AT-Ⅲ缺乏的病人在妊娠时出现流产的可能性增大，且认为AT-Ⅲ缺乏者发生早中期流产的风险增加了2 倍，发生死产的可能增加了5 倍[8]。马水清对57例既往有不明原因自然流产史的妇女与50例健康妇女进行研究，结果表明有妊娠流产史的妇女AT-Ⅲ缺陷的发生率均较正常人群为高[9]。
凝血酶形成后即与AT-Ⅲ以1：1结合，然后水解精氨酸385位以后的肽链，精氨酸残基与凝血酶的丝氨酸活性中心结合，形成二价酯键，形成复合物，即凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)，它是反映凝血酶已形成的敏感指标。Fujii 等发现TAT对下肢深静脉血栓有预测价值[10]。Tsia等[11]检测肾病综合征患者TAT水平，均明显高于正常组，1年后均发生血栓栓塞并发症，提示TAT对PTS的出现有重要意义。
本实验结果表明：复发性流产未孕妇女TAT水平高于正常未孕妇女(中位数0.46 μg/L vs 0.31 μg/L)，AT-Ⅲ水平低于正常未孕妇女(中位数0.35 μg/L vs 0.39 μg/L)，但差别均无统计学意义(P &> 0.008)。复发性流产早孕妇女TAT水平高于正常早孕妇女(中位数0.69 μg/L vs 0.66 μg/L)，AT-Ⅲ水平低于正常未孕妇女(中位数0.36 μg/L vs 0.42 μg/L)，但差别均无统计学意义(P &> 0.008)。本实验结果不能证明TAT与AT-Ⅲ是复发性流产患者是否存在血栓前状态的筛查指标，可能与样本量小有关，有待进一步探讨。
体内血液呈高凝状态，凝血酶原活化为凝血酶以启动凝血，F1+2水平升高。同时，内源性纤溶系统也自发活化。D-Dimer是交联纤维蛋白(Fb)特异的降解产物，它的生成或增高反应了凝血和纤溶系统的激活[12]。可作为体内高凝状态和纤溶亢进的分子标志物之一。Koh SC[13]研究发现在妊娠并发症如妊娠高血压疾病、胎儿宫内生长受限、水肿胎中，D-Dimer水平高与正常妊娠妇女。本实验结果显示：复发性流产未孕妇女D-Dimer水平较正常未孕妇女高(中位数184.00 μg/L vs 125.00 μg/L)，差别有统计学意义(P &< 0.008)。而且流产3次者较2次者指标水平高，差别有统计学意义(P &< 0.016 7)，表明：D-Dimer可作为复发性流产未孕人群是否存在血栓前状态的筛查指标，其最佳筛查界值为233.50 μg/L(AUC = 0.636)。随着流产次数增加，该指标上升。流产4次者较流产3次以上者水平稍高，但差别无统计学意义(P &> 0.0167)。流产3次和4次以上没有差异的原因，可能实际上两组没有差异，即该指标上升到一定水平后上升程度减弱或甚至停止。也可能是因为样本量太小，差别未能显示统计学意义。
本研课题两早孕组对比，复发性流产早孕组中F1+2、TAT、D-Dimer较正常早孕组升高(F1+2中位数193.4 nmol/L vs 179.95 nmol/L;TAT中位数0.69 μg/L vs 0.66 μg/L;D-Dimer中位数212.00 μg/L vs 201.50 μg/L)，AT-Ⅲ较正常早孕组有所下降(AT-Ⅲ中位数0.36 μg/L vs 0.42 μg/L)，但差别均无统计学意义(以上P &> 0.008)。可能因样本量小，差别未显示统计学意义，需要扩大样本进一步探讨。
综上所述，血栓形成是凝血和抗凝及纤溶等多种因素改变的综合作用下发生的，这些因素在血栓形成之前已经发生不同程度的变化，因而通过对这些变化的联合检测有可能尽早发现血栓前状态。本研究结果提示复发性流产患者在孕前检测血栓前状态标志物F1+2、D-Dimer值已有升高，提示孕前已经存在血栓前状态。因此，复发性流产患者尽早进行血栓标志物的检测，对复发性流产患者的病因确定和早期治疗具有重要意义。
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