作者：洪良庆 黄正宇 欧阳斌 杨培生 缪斌 华学锋
【摘要】 【目的】 探讨血清IL-12P70、IL-4、IFN-?酌在预测肾移植受者早期免疫状态的作用。【方法】 选取中山大学附属第三医院肾移植科行同种异体尸肾移植患者52例，其中男28例，女24例，平均年龄42.3岁，将患者分为正常组(n = 30)、急排组(n = 12)和感染组(n = 10)。分别于术前，术后第1、5天检测其血清IL-12P70、IL-4、IFN-?酌这3种细胞因子浓度。数据统计使用SPSS 15.0，P &< 0.05被认为有统计学意义，使用方差分析并加行LSD-t和SNK-q检验以检验3组患者3种细胞因子浓度的组间差异，作 ROC曲线、计算机处理ROC曲线下面积(Az)，以评价这3种细胞因子对急性排斥反应的诊断价值。【结果】 三组患者术前及术后第1天血清IL-12P70、IFN-?酌、IL-4浓度和IFN-?酌/IL-4均无统计学差异;术后第5天各组患者血清IL-4浓度无统计学差异;急排组血清IL-12P70、 IFN-?酌浓度和IFN-?酌/IL-4均显著高于正常组和感染组;急排组术后第5天血清IL-12P70、IFN-?酌水平较术前和术后第1天明显上升(9.012 ± 0.736 vs 6.613 ± 0.598;40.402 ± 13.414 vs 31.539 ± 13.323，P &< 0.05); IL-12P70、IFN-?酌、IL-4、IFN-?酌/IL-4在术后第5天的ROC曲线下面积分别为0.975，0.808，0.492，0.708;当IL-12P70浓度取值7.40 pg/mL时或IL-?酌取值31.48 pg/mL时，对急性排斥反应预测的敏感度和特异度分别达到100%、85%或83.3%、85%。【结论】 血清IL-12P70、IFN-?酌水平对肾移植受者移植术后早期的免疫状态有较好的预测价值;当血清IL-P70浓度高于7.40 pg/mL或IFN-?酌浓度高于31.48 pg/mL时须高度怀疑急性排斥反应发生的可能性。
【关键词】 白细胞介素12P70; 白细胞介素4; ?酌干扰素; 肾移植; 急性排斥;预测
Abstract： 【Objective】 To study the values of serum IL-12P70， IFN-?酌， and IL-4 concentration in prediction of early immune state of the renal allograft recipients. 【Methods】 The subjects were 52 patients (28 men and 24 women， mean age 42.3 years， S = 13.9) who underwent renal allograft transplantation from a cadaveric donor between January 2008 and December 2009 at Department of Renal Transplantation of The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University. They were pided into 3 groups： Normal， acute rejection， and infection group. Serum samples were collected before transplantation and at 1， 5 days post-transplantation. IL-12P70， IFN-?酌 and IL-4 serum level were determined by an Double-antibody-boated ELISA method using Invitrogen system kits. By contrast the cytokines levels among the three group patients， the value of the cytokines profiles in indicating immune state was studied prospectively. A P value of 0.05 or less using the SPSS software (version 15.0) was considered significant. The difference of the serum concentrations of these cytokines among the three groups was tested using One-Way ANOVA， and LSD-t test and SNK-q test were used to test the difference between groups. Receiver operating characteristic (ROC) curve was used to evaluate the diagnosis value of the variables. 【Results】 There were no significant differences in the mean pre-transplantation and at 1 day post-transplantation serum IL-12P70， IFN-?酌 concentration and IFN-?酌/IL-4 among the three 随着免疫抑制剂的应用和发展，肾移植术后人/肾的存活率均有了显著提高，免疫抑制的不足或过量所引起急性排斥反应或感染是影响肾移植受者长期预后的危险因素[1-2]。因此，监测肾移植受者免疫状态有助于指导个体化免疫抑制方案的应用从而改善长期预后。细胞因子作为调节免疫应答的重要介质，在免疫排斥或免疫耐受中起着关键的作用。研究证明由移植物激活的T辅助细胞产生的细胞因子的类型和数量在诱发针对移植物的排斥/耐受的方向中起着重要的作用[3]，因此，在移植的初始阶段检测移植受者的细胞因子水平可以早期判断受者机体免疫状态从而预测及预防急性排斥反应/感染的发生。我们这项前瞻性研究是通过监测肾移植受者术后早期不同时间段IL-12P70、IL-4、IFN-?酌的血清浓度水平，观察并比较它们对急性排斥反应/感染的预测价值，从而为临床免疫抑制方案的调整提供依据。
1 材料和方法
1.1 病例选择
2008年1月至2008年12月在中山大学附属第三医院肾移植科行同种异体肾移植术，并排除再次肾移植、群体反应性抗体(PRA)阳性以及合并乙型肝炎病毒感染、结核、克罗恩病、多发性硬化、关节炎疾病的患者后共52例患者进入研究，其中男28例，女24例，平均年龄42.3(S = 13.9)岁;根据术后一月内是否发生急性排斥反应或感染将患者分为急排组、感染组和正常组;各组患者原发病类型(未列出)、平均年龄、性别比例、透析时间、透析方式以及HLA位点相配数无统计学差异(表1)，供、受者血型均相同。
1.2 免疫抑制剂方案
术中静脉应用甲基泼尼松龙1.0 g，术后0.5 g/d，3 d后改为泼尼松口服，30 mg/d，后逐渐递减;采用环孢素(CsA)/他克莫司(FK506) + 吗替麦考酚酯 + 泼尼松三联免疫抑制维持方案;CsA起始量5 ～ 6 mg/(kg·d)，FK506起始量为0.10 ～ 0.15 mg/(kg·d)，均分2次服用，以后根据血药浓度谷值调整其用量;当出现急性排斥反应时静脉给予甲基泼尼松龙冲击治疗，0.5 g/d，连续3 ～ 5 d;对激素抵抗型排斥反应给予兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白(ATG，法国赛达)冲击治疗，1.5 mg/(kg·d)，连续5 ～ 10 d。
1.3 确诊标准
① 急性排斥反应的诊断：有发热、畏寒、移植肾区触痛和少尿等临床症状;实验室检查有血肌酐、尿素氮升高;予甲基泼尼松龙或抗胸腺淋巴细胞球蛋白(ATG)抗排斥治疗后症状可缓解，血肌酐、尿素氮可进行性下降;或移植肾彩色多谱勒超声检查，发现移植肾增大、肾皮髓质界面模糊、各级动脉阻力指数增高;或经移植肾穿刺病理活检证实。② 肺部感染的诊断：患者有咳嗽、咳痰、胸闷、气促等临床表现，双肺听诊可为呼吸音粗，干湿性啰音，X线胸片见肺纹理增粗，双肺弥漫性阴影或局部阴影。
1.4 血清IL-12P70、IL-4、IFN-γ的采集与检测
分别在移植术前、移植术后第1、5天3个时间点抽取患者外周血3 mL (不抗凝干燥管)，室温放置2 h或4 ℃过夜后离心(1 000 r/min， r = 12 cm， 20 min)，分离血清，将血清置于-80 ℃冰箱保存，避免反复冻融，以供检测。用双抗体夹心ELISA法检测血清IL-12P70、IL-4、IFN-γ水平。ELISA试剂盒购自Invitrogen公司。THERMO Multiskan MK3 全自动酶标仪由中山大学附属第三医院中心实验室提供，自动洗板机型号为CA-200;用SPSS 15.0根据标准品浓度及平均吸光度值制作一条标准曲线，以标准品浓度作横坐标，吸光度值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点并计算吸光度值与平均吸光度值相关性公式，各样本中的细胞因子含量通过相应样本吸光度值来计算。
1.5 统计分析
计量资料采用x ± s表示，对3组患者3种细胞因子浓度采用方差分析并加行LSD-t和SNK-q检验以检验两组间差异;计数资料采用卡方检验;采用C-统计值，即受试者特征曲线(ROC曲线)下的面积评价IL-12P70、IL-4、IFN-γ对急性排斥反应的预测准确性(C-统计值≥0.8，模型有非常好的预测准确性;0.7 &< C-统计值 &< 0.8，模型有临床应用价值)，并根据ROC曲线的敏感性和特异性决定MELD的最佳临界值。所有数据统计采用SPSS 15.0软件包处理，P &< 0.05为差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 临床转归
在正常、急排、感染三组患者中使用以FK506为主的免疫抑制剂方案的分别有12、6、4例，使用以CsA为主的免疫抑制剂方案分别有18、6、6例，用精确概率方行卡方检验三组间无统计学差异(P = 0.736)。在急排组的12例患者中，10例使用甲基泼尼松龙冲击治疗后控制，2例为耐激素型，使用兔抗胸腺细胞免疫球蛋白制剂后肌酐可逐渐下降至正常，该组所有患者人/肾均存活;感染组的10例患者均表现为肺部感染，以发热、气促、胸闷为首发症状，无明显咳嗽、咳痰，白细胞无明显升高，胸片检查有6例可见肺纹理增粗，4例可见实变影;4例血CMV-pp65(+)，2例行支气管纤维镜检查并取肺泡组织活检确诊为CMV感染，该组患者经下调/暂停免疫抑制剂，予以抗病毒、细菌、真菌以及加强营养支持等综合治疗后痊愈。
2.2 各时间点血清IL-12P70、IL-4、IFN-γ浓度变化
三组患者术前及术后第1天血清IL-12P70、IFN-?酌、IL-4浓度和IFN-?酌/IL-4比值均无统计学差异;术后第5天各组患者血清IL-4浓度无统计学差异，而急排组血清IL-12P70、IFN-?酌浓度和IFN-?酌/IL-4比值均显著高于正常组和感染组(表2)。
急排组术后第5天血清IL-12P70、IFN-?酌水平(pg/mL，图1)较术前和术后第1天明显上升，结果具有统计学差异(9.012 ± 0.736 vs 6.613 ± 0.598;40.402 ± 13.414 vs 31.539 ± 13.323，P &< 0.05);IL-4和IFN-?酌/IL-4比值在各时间点则无明显差异;感染组和正常组各时间点血清IL-12P70、IFN-?酌、IL-4浓度和IFN-?酌/IL-4比值均无统计学差异。
2.3 ROC曲线下面积
术前IL-12P70、IFN-?酌、IL-4浓度及IFN-?酌/IL-4比值的ROC曲线下面积(Az)分别为：0.642， 0.558，0.488和0.517;术后第1天IL-12P70、IFN-?酌、IL-4浓度及IFN-?酌/IL-4比值的ROC曲线下面积(Az)分别为：0.517， 0.438， 0.575 和 0.475;术后第5天IL-12P70、IFN-?酌、IL-4浓度及IFN-?酌/IL-4比值的ROC曲线下面积(Az)分别为：0.975， 0.808， 0.492 和 0.708(图2)。根据 ROC曲线下面积可知术后第5天IL-12P70对术后急性排斥反应的预测价值较大，IFN-?酌浓度及IFN-?酌/IL-4比值对术后急性排斥反应的预测价值中等。
2.4 预测急性排斥反应各因子临界值的确定
根据ROC曲线，术后第5天血清IL-12P70、IFN-?酌浓度及IFN-?酌/IL-4比值3个指标预测急性排斥反应的临界点、敏感度和特异度见表3。
3 讨 论
细胞因子作为调节免疫应答的重要介质常常在免疫排斥反应的初期、甚至起始阶段既可出现明显变化[4]，多项研究表明，在排斥反应过程中常伴有Thl型细胞因子的表达增高和Th3型细胞因子的不表达或低表达，而在免疫耐受时则相反[5- 6]。因此，检测移植受者细胞因子水平和了解Th1/Th3之间的平衡，对早期预测患者发生急性排斥反应及判断受者机体免疫状态有一定的意义。
本研究结果显示急排组术后第5天血清IFN-?酌和IL-12P70水平较术前和术后第1天明显升高，而感染组和正常组则无显著变化;另外该时间点急排组血清IFN-?酌、IL-12P70浓度和IL-4/IFN-γ比值明显高于感染组和正常组。急排组12例患者均于随后的0 ～ 5 d(即术后第6 ～ 10天)发生急性排斥反应，这说明IFN-?酌、IL-12P70浓度的升高在一定程度上与急性排斥反应有关。Amirzargar等[7]发现急性排斥组患者IFN-?酌水平从术后1周开始逐渐升高，排斥前达到最大值，而在未排斥组IFN-?酌维持在较低水平，这与我们的结果相似。本研究中术前及术后第1、5天3组患者之间血清IL-4水平均无统计学差异，故IL-4在评价肾移植受者免疫状态，预测急性排斥反应的作用尚待考证。另急排组IFN-γ/IL-4比值显著高于正常组(14.927 ± 9.445 vs 9.345 ± 3.082， P &< 0.01)也提示IFN-γ/IL-4比值在一定程度上反映了Th1/Th3的平衡状态。在移植物排斥反应中，抗原提呈细胞(主要是树突状细胞)在效应性T细胞的活化中起到了重要的作用。IL-12P70是由树突状细胞活化后产生，可促进Th0细胞分化为Th1细胞，并促进IFN-γ、TNF-?酌和IL-2合成，而抑制Th3细胞合成IL-4、IL-10[8]。相反当缺乏IL-12P70时，DC细胞则促进Th0细胞分化为Th3细胞。因此当IL-12P70浓度上升时，可以诱导Th1/Th3失衡，并使Th1型细胞因子生成增加，从而加速急性排斥反应的发生。有研究表明通过RNA干扰技术抑制IL-12P70表达可诱导免疫耐受，因此理论上检测IL-12P70水平可以预测急性排斥反应的发生。本研究显示术后第5天急排组血清IL-12P70P水平显著增高，随后的0 ～ 5 d这12名患者均发生急性排斥反应。从理论上讲，各时间点的IL-12P70与IFN-γ可呈正相关，在IFN-γ升高之前可有IL-12P70的升高，但在本实验对各时间点的这两个指标进行相关性分析并未发现二者有相关性，也未发现有在IFN-γ升高之前出现的IL-12P70的升高，这可能与体内细胞因子呈现网络性，尚存在其它因素导致IFN-γ升高有关，除了IL-12P70/IFN-γ途径外，尚存在其它的一些激活T细胞的途径，比如IL-23/IL-17途径在免疫应答中起了重要的作用[9]。我们进一步使用ROC曲线下面积(Az)分析术后第5天IL-12P70、IFN-γ及IFN-γ/IL-4比值对术后急性排斥反应预测的价值，发现IL-12P70对术后急性排斥反应的预测价值最大(ROC曲线下面积为0.975)，而IFN-γ及IFN-γ/IL-4对术后急性排斥反应的预测价值中等。另外当IL-12P70浓度取7.4 pg/mL时，对急性排斥反应预测的敏感度和特异度最高，达到100%和85%，而使用IFN-γ及IFN-γ/IL-4比值作为预测指标时，其敏感度均为83.3%，特异度分别为85%和65%，因此IL-12P70作为急性排斥反应的预测指标要优于IFN-γ及IFN-γ/IL-4比值。
本研究未发现感染组与正常组在各时间点血清细胞因子浓度的差异，这可能与出现感染时间距检测时间较长有关。感染组10例患者均在术后3 ～ 6个月发生感染，而细胞因子变化仅能反映短期机体免疫状态(对随后0 ～ 5 d内是否发生急性排斥反应有一定预测作用)，对随后较长时间内是否发生感染可能并无预测作用。由于急性排斥反应多发生于术后1个月内，尤其是术后2周，因此围术期定期检测血清IL-12P70水平，并根据浓度及时调整免疫抑制方案，有助于减少术后急性排斥反应的发生。
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