作者：孙月丽 吴明玮 曾昭蕾 孙健 蔡于琛 冼励坚 赵擎宇
【摘要】 【目的】 探讨PPAR-γ选择性抑制剂T0070907影响鼻咽癌(NPC)细胞体外生长的作用机制。【方法】 通过RT-PCR和Western blotting检测PPAR-γ受体在5株NPC细胞株(CNE1、CNE2、HONE1、SUNE1和5-8F)中mRNA和蛋白水平的表达;MTT法检测T0070907对NPC细胞生长情况的影响;流式细胞术和Western blotting检测T0070907对NPC细胞的细胞周期和细胞周期相关蛋白表达的影响。【结果】 PPAR-γ在5株NPC细胞中均有表达;T0070907对NPC细胞株有明显生长抑制作用，并呈浓度、时间依赖性;T0070907作用于NPC细胞CNE1和CNE2后，G2/M期细胞比例则逐渐增加，且随着处理浓度的增加而增加，各组间差异有统计学意义(P &< 0.05)。此外，随着T0070907处理浓度的增加，NPC细胞的细胞周期相关蛋白Cyclin A、Cyclin B1、Cdc2、Cdk2蛋白的表达逐渐下降，无活性的pCdc2蛋白表达则逐渐增强。【结论】 PPAR-γ抑制剂T0070907能够抑制NPC细胞PPAR-γ的蛋白表达，并通过对细胞周期相关蛋白Cyclin A、Cyclin B1、Cdc2、Cdk2、pCdc2等蛋白的调控导致细胞周期G2/M期阻滞，从而抑制NPC细胞的生长。
【关键词】 PPAR-γ; 鼻咽癌; T0070907; 细胞周期; G2/M期
Abstract： 【Objective】 PPAR-γ (peroxisome proliferator-activated receptor-γ) antagonists have been documented to induce cancer cell proliferation inhibition and apoptosis. In the present study PPAR-γ’s effect on cell growth of NPC cell lines and the possible mechanism was investigated via its selective inhibitor T0070907. 【Methods】 PPAR-γ mRNA and protein expression in five human NPC cell lines (CNE1， CNE2， HONE1， SUNE1， and 5-8F) was detected with RT-PCR and Western blotting analysis. NPC cells growth inhibition by T0070907 was measured by MTT assay， and cell cycle arrest of NPC cells treated with T0070907 was assayed by fluorescence-activated cell sorter (FACS) analysis. Cell cycle-associated protein expression was detected by Western blotting. 【Results】 PPAR-γ was expressed both at mRNA and protein levels in five NPC cell lines. NPC cells’ proliferation was significantly inhibited by T0070907， and the growth inhibition was dose- and time-dependent. CNE1 and CNE2 cells treated for 48 h with T0070907 markedly accumulated dose-dependently in the phase of G2/M， while they differed significantly (P &< 0.05) in the phase as well. T0070907 suppressed expression of cell cycle-related proteins including Cyclin A， Cyclin B1， Cdc2， and Cdk2 but increased pCdc2 expression. 【Conclusion】 PPAR-γ inhibitor T0070907 could induce proliferation inhibition of NPC cells to the phase of G2/M， and this cell cycle arrest might result probably from regulation of Cyclin A， Cyclin B1， Cdc2， Cdk2， and pCdc2.
过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ)属于细胞核受体超家族成员，PPAR-γ与激活配体结合才能被活化，激活后与维甲类X受体(RXR)结合形成异二聚体，该异二聚体与靶基因启动子的应答元件(peroxisome proliferator response elements， PPREs)结合，同时招募共刺激因子调节靶基因的转录[1]，由此在脂肪形成、糖脂代谢及炎症反应等生物学效应中发挥重要作用[2]。近年来，PPAR-γ与肿瘤的关系成为研究热点。业已证实PPAR-γ在多种恶性肿瘤组织中均有表达，如肺癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌及乳腺癌等[3]。许多研究表明，通过抑制PPAR-γ的表达能够抑制诸如肝癌、食管癌等肿瘤细胞的生长，诱导细胞凋亡、引起细胞周期阻滞、降低肿瘤细胞粘附及转移能力[4-7]，提示PPAR-γ可以作为治疗肿瘤的分子靶点之一，但其在我国广东地区高发的鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)中的研究仍未有报道。NPC是我国常见的头颈部肿瘤，95%以上为低分化鳞癌和未分化癌，恶性程度高，生长快，易发生转移，75%患者确诊时已属晚期，单一放疗对于晚期患者疗效欠佳[8]，目前化疗成为晚期NPC治疗的主要手段之一，但现有化疗疗效不尽人意，分子靶向药物的发展为NPC的治疗带来新的机遇，为此我们选择PPAR-γ抑制剂T0070907进行研究，探讨其作为治疗NPC分子靶向药物的可能性。T0070907是一种新型合成的PPAR-γ抑制剂，化学式为C12H8ClN3O3，对PPAR-γ具有较强的亲和力和较高的选择性，通过影响PPAR-γ配体结合域第12螺旋的构象调节PPAR-γ和共刺激因子的相互作用而抑制PPAR-γ的活化[9]，且其毒性较小[10]。
1 材料与方法
1.1 试剂及仪器
RPMI-1640培养液由中山大学肿瘤防治中心实验研究部配制，胎牛血清(foetal calf serum，FCS)购自杭州四季青公司;T0070907为美国Cayman公司产品，MTT(3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenyl tetrazolium bromide)为Sigma公司产品;Trizol为美国Invitrogen公司产品，RT一链合成试剂盒及PCR Mix Perfectshot Taq为大连宝生物有限公司(Takara公司)产品;兔抗人PPAR-γ、Cdk2、Cyclin A、pCdc2多克隆抗体及鼠抗人Cyclin B1、Cdc2单克隆抗体为Santa Cruz公司产品;Thermo Multiskan MK3酶联免疫检测仪来自Thermo公司，FACScaliber流式细胞仪购自美国BD公司，垂直电泳仪、电转装置及凝胶图像分析仪为Bio-Rad公司产品。
1.2 细胞培养
人NPC细胞株CNE1、CNE2、SUNE1、HONE1及5-8F由中山大学肿瘤防治中心实验研究部提供，其中CNE1、CNE2分别代表高分化和低分化NPC细胞株，HONE1代表EBV+的NPC细胞株;SUNE1代表高转移性NPC细胞株;5-8F为SUNE1的亚株，具有高转移性，高成瘤性。所有细胞用含100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基在37 ℃、体积分数5%CO2条件下培养。细胞呈单层贴壁生长，细胞倍增时间约是48 h。所有实验均在细胞对数生长期进行。
1.3 RT-PCR法检测PPAR-γ mRNA的表达
用Trizol法分别提取各细胞总RNA，紫外分光光度法鉴定其浓度，取2 μg RNA进行逆转录，以GAPDH基因的表达作为内参照进行PCR扩增，每个样本重复3次。实验结果以均数表示。PPAR-γ基因片段(474 bp)引物序列：上游为5′-TCTCTCCGTAATGGAAGACC-3′，下游为5′-GCAT TATGAGACATCCCCAC-3′;GAPDH基因片段(322 bp)引物上游序列为：5′-CGGGAAGCTTGTCAT CAAT GG-3′，下游为5′-GGCAGTGATGGCATGGA CTG-3′。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min;然后94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s共30个循环;最后72 ℃延伸7 min。取反应产物5 μL，在溴乙錠染色、1.5%的琼脂糖凝胶下130 V电泳30 min，在紫外凝胶成像仪下观察并拍照。
1.4 Western blot检测PPAR-γ蛋白及细胞周期相关蛋白的表达
收集对数生长期细胞，加入2 × SDS细胞裂解液提取细胞总蛋白，用紫外分光光度法检测蛋白浓度。调整蛋白浓度，用8%的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分离，然后转移至硝酸纤维素膜上，50 mL/L的脱脂牛奶封闭2 h，加入PPAR-γ、Cyclin A、Cyclin B1、Cdc2、Cdk2、pCdc2及GAPDH一抗(1：200)，4 ℃电动摇床孵育过夜，用三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(tris-buffered saline tween 20， TBST)洗膜，加入相应二抗，室温下孵育1 h，TBST洗膜后用ECL试剂盒(Cell Signal公司)感光，冲片，扫描后用Quantity-One软件进行灰度分析。
1.5 MTT法检测PPAR-γ抑制剂T0070907对NPC细胞增殖的影响
将细胞以每孔2500的密度种植于96孔板，实验分为T0070907组、阳性对照组和阴性对照组。带24 h细胞贴壁后加入药物，阳性对照组加入顺铂(Cisplatin，DDP)，阴性对照组不加任何药物处理。每个浓度设3个平行孔，置37 ℃、体积分数5% CO2条件下培养68 h，然后加入20 μL 5 mg/mL MTT，继续培养4 h，弃培养液，加入200 μL DMSO原液，在微量振荡器上振荡10 min，待完全显色后，用酶联免疫检测仪于570 nm和630 nm波长处测每孔的吸光度值(A值)。Bliss法计算程序求出半数抑制浓度(50% inhibitory concentration， IC50)。按下述公式求出增殖抑制率，抑制率 = (对照组A均值-用药组A均值)/对照组A均值 × 100%。所有实验均重复3次。
1.6 流式细胞仪检测细胞周期阻滞情况
将NPC细胞以6 × 104/mL接种于6孔板，培养24 h后加入不含血清的不同浓度的T0070907，作用48 h后收集各细胞，用预冷的PBS液洗涤2次，70%冰乙醇固定过夜，514 × g离心10 min，弃去乙醇，再次悬浮于PBS，细胞经碘化丙啶(PI)10 μg/mL染色5 min，4 ℃避光30 min后，在流式细胞仪上检测细胞DNA含量，根据DNA含量在流式细胞仪中得出每份样品的G1、S和G2/M期细胞分布图以及各时期所占比例。LYSIS软件(Becton-Dickinson公司)进行细胞周期分析。
1.7 统计学分析
用SPSS 10.0统计软件处理数据，采用单因素方差分析进行多个样本均数的比较。统计学处理P &< 0.05认为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 PPAR-γ在NPC细胞株中的表达情况
RT-PCR和Western blotting检测结果显示，PPAR-γ在NP69、CNE1、CNE2、HONE1、SUNE1、5-8F细胞中均有表达，各条带灰度与对照组灰度比值统计分析显示，条带间差异有统计学意义(P &< 0.05)，且PPAR-γ的表达在NPC细胞株中明显较正常鼻咽上皮细胞株NP69高，低分化细胞株CNE2较高分化细胞株CNE1高，差异有统计学意义(P &< 0.05，图1)。
2.2 T0070907对NPC细胞PPAR-γ蛋白表达的影响
CNE1、CNE2分别为高分化和低分化的NPC细胞株，Western blotting 检测结果显示，用不同浓度的T0070907(6.25、12.5、25 μmol/L)处理后，CNE1、CNE2细胞中PPAR-γ蛋白的表达下降，且随着药物浓度的升高下降越明显。各浓度组之间的差异有统计学意义(CNE1组：F = 159.58，P &< 0.05;CNE2组：F = 178.03，P &< 0.05)。相同T0070907浓度的CNE1、CNE2细胞间的PPAR-γ蛋白的表达差异无统计学意义(P &> 0.05，图2)。
2.3 T0070907对NPC细胞增殖的影响
MTT法结果显示，不同浓度的T0070907对5种NPC细胞均有增殖抑制作用，且随药物浓度的增加，抑制作用更趋明显(图3)。T0070907对CNE1、CNE2、HONE1、SUNE1、5-8F细胞的IC50值分别为12.61 ± 0.48、14.40 ± 0.71、20.5 ± 0.35、(26.93 ± 1.03) ?滋mol/L以及(19.23 ± 1.31) μmol/L，除5-8F和HONE1细胞外，各组间差异均有统计学意义(F = 131.2， P &< 0.05)。对CNE1、CNE2细胞的增殖抑制情况结果显示，随着作用时间的延长，增殖抑制作用越明显。所以，T0070907的增殖抑制作用呈浓度和时间依赖性(图4)。
2.4 T0070907对NPC细胞周期的影响
T0070907对CNE1、CNE2细胞增殖抑制作用比较明显，且两种细胞分别为高分化和低分化细胞株，故检测T0070907对这两种细胞周期的影响。结果显示，T0070907可以使CNE1、CNE2细胞G2/M期比例增加，随着用药浓度的增加，处于G1期的细胞比例降低，S期细胞比例变化不大，而G2/M期的细胞比例明显增加，各浓度组间差异有统计学意义(CNE1组：F = 110.4， P &< 0.05， CNE2组： F = 308.2， P &< 0.05)，而CNE1、CNE2相同浓度组G2/M期阻滞的细胞数差异没有统计学意义(P &> 0.05，表1)。
2.5 T0070907对NPC细胞周期相关蛋白表达的影响
Western blotting结果显示，T0070907(6.25、12.5、25 μmol/L)处理后，细胞周期相关蛋白Cyclin A、Cyclin B1、Cdc2、Cdk2的表达较空白对照组明显下降，且随着处理药物浓度的增加下降越明显，磷酸化的Cdc2表达则逐渐增强(P &< 0.05，图5、6)。
3 讨 论
3.1 PPAR-γ在肿瘤中的表达
PPAR-γ在人类多种肿瘤细胞中均有表达，并对增殖、分化及凋亡具调节作用[3-4]。细胞水平的检测结果显示，PPAR-γ在正常鼻咽上皮细胞和NPC细胞中均有表达，但前者的表达明显低于后者，高分化NPC细胞CNE1中的表达低于低分化NPC细胞CNE2中的表达。Zhang等[11]研究表明PPAR-γ在正常卵巢中无表达，8例良性和10例边界性肿瘤中仅各有1例胞浆中的微弱表达，而28例恶性卵巢肿瘤中有26例表达。Sahin等[12]应用免疫组织化学方法检测甲状腺滤泡状腺瘤(FA)、滤泡状腺癌(FTC)和Hurthle细胞瘤(HCN)中PPAR-γ的表达情况，发现FTC中的表达较HCN、FA中明显增高(57% vs. 4%、13%)，说明PPAR-γ的表达可能与细胞恶性程度有关。
3.2 PPAR-γ抑制剂的抗肿瘤作用
有关PPAR-γ抑制剂的抗肿瘤作用已有报道。Burton等[4]用PPAR-γ的抑制剂T0070907、GW9662对7株造血细胞来源的和9株上皮细胞来源的癌细胞的体外细胞增殖抑制作用进行了研究，结果表明，T0070907和GW9662具有明显的增殖抑制作用。Schaefer等[6]报道T0070907抑制PPAR-γ后可阻止肝癌细胞细胞外基质的粘附，诱导细胞失巢凋亡;Nakajima等[13]报道T0070907能够明显抑制胰腺癌的动物模型中肿瘤的转移能力。本研究同样发现，PPAR-γ抑制剂T0070907抑制了NPC细胞株PPAR-γ的表达，对该肿瘤细胞生长具抑制作用。
3.3 PPAR-γ抑制剂T0070907抗肿瘤作用的机制
从文献报道来看，PPAR-γ抑制剂抗肿瘤作用的机制主要涉及细胞周期阻滞、细胞凋亡诱导、抑制血管生成和降低细胞侵袭力等几个方面。本研究结果显示PPAR-γ抑制剂T0070907对NPC细胞的增殖抑制主要与细胞周期的阻滞有关，NPC细胞经T0070907处理后明显被阻滞于G2/M期。
CDK2与cyclin A结合是G2期事件启动和进行的必要条件，有丝分裂促进因子即Cdc2/Cyclin B1复合物是细胞从G2期进入M期的重要调节因子，Cyclin B1的表达直接影响Cdc2的活性[14]。本实验结果显示，经T0070907处理后的NPC细胞，细胞周期相关蛋白Cyclin A、Cyclin B1、Cdc2和Cdk2等的表达明显下降，而磷酸化的Cdc2蛋白的表达逐渐增强，由此我们推测，T0070907抑制PPAR-γ后可能通过下调NPC细胞Cyclin B1的表达使得Cdc2发生磷酸化，抑制了Cdc2的活性，导致细胞阻滞于G2/M期。T0070907对CDK2与cyclin A的下调也使得细胞无法进行有丝分裂。
作为PPAR-γ的抑制剂，T0070907与PPAR-γ的Cys313共轭结合引起分子构象的改变，阻止了PPAR-γ/RXR异二聚体转录共激活因子的募集，由此抑制PPAR-γ的激活。但抑制PPAR-γ活化后如何调控细胞周期相关蛋白仍不清楚。Schaefer等[15]曾报道PPAR-γ抑制剂GW9662和T0070907通过微管蛋白的丢失引起了结肠癌细胞发生了凋亡和细胞形态改变，细胞被阻滞于M期。
我们推测，PPAR-γ抑制剂T0070907对NPC细胞的增殖抑制作用可能通过以下途径实现：T0070907与PPAR-γ结合后，抑制了PPAR-γ的活化，影响了某些基因的转录，从而调节细胞周期相关蛋白的表达。Cyclin B1的表达下降，磷酸化Cdc2表达增多，Cdc 2活性降低，加上CDK2与cyclin A的下调，使得细胞阻滞于G2/M期，这方面更具体机制尚待进一步研究。
综上所述，PPAR-γ抑制剂T0070907可明显抑制NPC细胞PPAR-γ的表达，并且引起细胞周期G2/M期阻滞，其机制可能是调控Cyclin A、Cyclin B1、Cdc2、Cdk2、pCdc2等蛋白的表达抑制了NPC细胞的增殖。
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