作者：商振球，陈永平，谷甸娜
【摘要】 目的 ：探讨钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制蛋白在急性肝衰竭模型中的表达情况及乌司他丁对其表达的影响。方法：通过腹腔注射D-氨基半乳糖（D-Gal）及脂多糖（LPS）建立大鼠急性肝衰竭模型。大鼠随机分为对照组、模型组及乌司他丁干预组。采用免疫组织化学方法检测钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制蛋白表达情况。结果：D-Gal/LPS联合注射成功诱导大鼠急性肝衰竭模型，与对照组相比，模型组钙蛋白酶及钙蛋白酶抑制蛋白表达增加（P &<0.05），但经乌司他丁干预后，钙蛋白酶表达较模型组明显减少（P &<0.05），而钙蛋白酶抑制蛋白的表达无明显变化（P＞0.05）。结论：乌司他丁可能通过抑制钙蛋白酶活性，同时保持钙蛋白酶抑制蛋白活性，从而减轻肝脏炎症损伤。
【关键词】 乌司他丁；钙蛋白酶；钙蛋白酶抑制蛋白；肝功能衰竭；急性
Abstract: Objective: To explore the changes of expression of calpain and calpastatin in acute liver failure，and to evaluate the effects of ulinastatin on the expressions of calpain/calpastatin. Methods: The model of acute liver failure (ALF) was induced by D-galactosamine (D-Gal) and lipopolysaccharide (LPS). Sixty-six Sprague Dawley (S-D) rats were pided randomly into three groups: control group， ALF group (model group) and ulinastatin group (intervention group). Hepatic samples were collected at 0h (control rats)，6 h，12 h，24 h，36 h and 48 h. The expression of calpain/calpastatin was detected with immunohistochemistry. Results: Compared with the control group，the expression of calpain/calpastatin in the model group and the intervention group increased significantly (P &<0.05). However，the level of calpain were marginally lower because of the application of ulinastatin in intervention group than model group (P &<0.05)，and there was no difference in the expression of calpastatin between the model group and intervention group (P &>0.05). Conclusion: These findings suggest that ulinastain provides critical protection against the liver injury induced by D-Gal/LPS. Moreover，the effect is likely due to the decreased expression of calpain and preserved the level of calpastatin
Key words: Ulinastatin；calpain；calpastatin；liver failure；acute
急性肝衰竭过程中肝脏损伤的机制尚未完全阐明。早期研究表明，钙蛋白酶是一个重要的肝细胞损伤递质[1]。本研究中，我们研究了钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制蛋白在急性肝衰竭模型中的表达情况，以及乌司他丁对其表达的影响，探讨钙蛋白酶/钙蛋白酶抑蛋白在急性肝衰竭肝脏损伤中的作用，以及乌司他丁治疗急性肝衰竭的可能机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组
清洁级健康Sprague-Dawley（S-D）雄性大鼠66只，质量190～260 g，室温喂养，由温州医学院实验动物中心提供。S-D大鼠66只，实验前禁食12 h，饮水不限。将大鼠随机分为，对照组：6只，腹腔注射0.9% NaCl 0.4 mL；模型组：30只，分为6、12、24、36和48 h 5个亚组，每组6只；干预组:30只，分为6、12、24、36和48 h，5个亚组，每组6只。
1.2 主要试剂
内毒素（LPS）购自北京宝希迪科技有限公司，D-氨基半乳糖（D-Gal）购自南通通吕生物制品有限公司，乌司他丁购于广东天普生化医药有限公司，兔抗大鼠Calpain I多克隆抗体购于英国Abcam公司，兔抗大鼠Calpastatin（H-300）多克隆抗体购于美国Santa Cruz Bio-technology公司，二步法免疫组化检测试剂和DAB显色盒购于北京中杉金桥公司。
1.3 实验方法[2]
将D-Gal溶于无菌0.9% NaCl溶液，用1 mol/L NaOH调pH 7.0，按800 mg/kg体质量给予大鼠腹腔注射，同时配制脂多糖（LPS）溶液，按40μg/kg体质量腹腔注射；乌司他丁干预组：30只，乌司他丁注射液每10万单位溶于2 mL无菌0.9% NaCl溶液中，造模后30 min腹腔注射，每千克体质量10万单位，造模药物剂量与亚组处理同模型组。上述各组动物在注射药物后在不同时间点，经10%水合氯醛0.35 mL/kg麻醉后，开腹取肝组织，于10%中性甲醛溶液固定，待病理及免疫组织化学检测。
1.4 免疫组织化学与苏木精-伊红染色
石蜡包埋4μm切片，采用二步法，经脱蜡，抗原微波修复，3% h3O2阻断内源性过氧化物酶，加钙蛋白酶一抗（1:100稀释，兔抗Calpain1-Domian IV多克隆抗体IgG，和1:50稀释兔抗Calpastatin多克隆抗体IgG）4 ℃温育过夜，加二抗（PV-6001，山羊抗或兔IgG抗体-HRP多聚体，购于北京中杉金桥）37 ℃水浴箱30 min，二氨基联苯胺（DAB）显色2 min，苏木精复染2 min，氨水返蓝，脱水、二甲苯透明，封片，镜检。在阳性标本上以PBS代替一抗作为阴性对照。用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测量肝组织平均积分光密度（IOD SUM），用以代表阳性部位蛋白表达水平。
1.5 统计学处理方法
采用单因数方差分析。方差齐性者两两比较采用LSD法，方差不齐者进行Dunnet’s T3检验。
2 结果
2.1 免疫组织化学结果显示，在正常肝组织中，肝实质细胞少量表达钙蛋白酶；在D-Gal/LPS联合作用后，肝细胞中钙蛋白酶阳性表达逐步增加，36 h到达高峰；而乌司他丁干预组钙蛋白酶表达较模型组明显减少（P &<0.05），见图1；与对照组相比，模型组钙蛋白酶及钙蛋白酶抑制蛋白表达增加（P &<0.05）；钙蛋白酶平均积分光密度见表1。
2.2 钙蛋白酶抑制蛋白在正常肝脏组织中有少量表达。造模后，其表达与钙蛋白酶同步增加，干预组钙蛋白酶抑制蛋白的表达较模型组无明显变化（P＞0.05），见图2，钙蛋白酶抑制蛋白平均积分光密度见表2。
3 讨论
钙蛋白酶是一组调节细胞功能的钙依赖性半胱氨酸蛋白酶，广泛存在于绝大多数哺乳动物组织和细胞中，是复杂的、高度调控的蛋白降解体系。钙蛋白酶抑制蛋白是一种内源性、需钙的钙蛋白酶抑制蛋白，在细胞内普遍存在，参与细胞的生长与代谢过程[3]。钙蛋白酶系统具有多种生理功能，涉及多方面。生理状态下，钙蛋白酶小部分激活，仅对目标底物有限地水解，其主要作用是维持细胞骨架的更新[4]。而在病理状态下，细胞内的钙超载会使钙蛋白酶过度激活，并降解底物蛋白，引起病理损伤[5]。在化学性肝脏损伤初期，肝组织暴露于阈浓度毒素后，肝脏细胞内线粒体和肝细胞和内质网的钙释放以及肝细胞膜通透性变化，导致细胞内钙浓度升高（钙超载）[6]。本实验显示：注射D-Gal/LPS后，随时间的推移，肝组织内钙蛋白酶的表达逐步增加，到36 h到达高峰，与肝脏缺血再灌注损伤时表现基本一致[7]。同时钙蛋白酶抑制蛋白的表达也同步增加。
肝细胞内钙蛋白酶-钙蛋白酶抑制蛋白平衡失调，钙蛋白酶在肝细胞内活性异常升高是导致肝细胞及组织损伤的主要机制之一[1]。乌司他丁是一种从人尿液中分离纯化的蛋白酶抑制剂，可抑制多种蛋白酶，糖及脂水解酶，还具有清除氧自由基、抑制炎症反应递质释放等功能，多用于治疗急性胰腺炎，肺损伤等[8-9]。本实验显示：与模型组相比，肝脏损伤指标ALT，AST明显降低（P＜0.01），肝组织炎症反应及肝细胞损伤明显减轻，同时干预组钙蛋白酶表达明显降低。提示乌司他丁可能通过抑制钙蛋白酶的表达，改善肝脏的炎症损伤。钙蛋白酶抑制蛋白是一组内源性非组织特异性钙蛋白酶抑制蛋白，其具有热稳定性，也可耐受多种变性剂如尿素、SOS或三氯乙酸等[10]。本实验显示：干预组钙蛋白酶抑制蛋白的表达较模型组无明显变化（P＞0.05）。提示钙蛋白酶抑制蛋白能耐受乌司他丁的作用，但其确切结构机制尚需进一步研究。
本实验通过D-Gal/LPS建立大鼠肝衰竭模型，观察组织钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制蛋白的变化，进一步证实了钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制蛋白的平衡失调，是急性化学性肝衰竭导致肝脏损伤的重要机制。乌司他丁可能通过抑制钙蛋白酶活性，同时保持钙蛋白酶抑制蛋白活性，从而减轻肝脏炎症损伤。
参考文献
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