作者：陆海燕，邓小龙，李光乾，李伟
【摘要】 目的 ：研究(JNK)在惊厥持续状态(SC)幼年大鼠海马中的表达及依达拉奉对其的影响。方法：雄性SD幼年大鼠120只分为正常对照组(NC组)、惊厥持续状态组(SC组)、依达拉奉组(EDA组)三大组;各大组均随机分为5组，分别于惊厥后4、12、24、48和72 h处死。采用氯化锂-匹鲁卡品法制作惊厥持续状态模型。EDA组在大鼠造模前三天予EDA腹腔注射，每天注射一次，连续3 d。TUNEL法检测观察大鼠海马细胞凋亡情况;免疫组化法检测海马p-JNK蛋白表达动态变化;RT-PCR技术检测海马JNK1 mRNA表达的动态变化。结果：SC组在惊厥12 h后的各时间点海马CA1区TUNEL阳性细胞数均显著高于NC组(P&<0.01)，而ED组TUNEL阳性细胞数均较SC组显著下降(P &<0.01或P &<0.05)。幼年大鼠海马CA1区p-JNK蛋白在SC组表达显著增强，与NC组比较差异有显著性(P &<0.01)，在EDA组表达较SC组明显下降(P &<0.01)。SC组海马JNK1 mRNA表达明显高于NC组(P &<0.01)，而在EDA组JNK1 mRNA的表达较SC组显著降低(P &<0.01)。结论：SC可诱导JNK的表达，促进SC后海马神经元凋亡;EDA预处理可以影响JNK的表达，减轻惊厥后海马神经元凋亡程度。
【关键词】 惊厥;脑损伤;幼年大鼠;JNK;依达拉奉
Abstract: Objective: To observe the change of JNK in the hippocampus of status convulsive rat and the regulation effect of EDA on it. Methods: One hundred and twenty male Juvenile Sprague-Dawley(SD)rats were randomly pided into normal control group (NC)， status convulsivus group (SC)， and edaravone group (EDA);and every group were randomly pided into five groups， which would be executed at 4 h，12 h，24 h，48 h and 72 h after convulsion discontinued. Status convulsivus (SC)was induced by injecting Lithium Chloride and Pilocarpine. Group EDA were injected EDA before convulsion，and repeatedly every day for 3 days. The expression of apoptosis cells were observed with TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL)，the changes of p-JNK protein in the hippocampus CA1 domains were detected with immunohistochemistry(IHC)，the expression of JNK1 mRNA were detected with RT-PCR. Results: The TUNEL positive cells in hippocampus CA1 of SC group were more than that of NC group at 12 h after the SC(P &<0.01). After the intervention of edaravone，TUNEL positive cells showed a significant drop (P &<0.01 or P &<0.05). The expression of p-JNK protein in the hippocampus CA1 domains increased markedly in SC group. The difference was statisticaly significance compared with NC group (P &<0.01)， and EDA group was much lower than SC group (P &<0.01). The expression of JNK1 mRNA in the hippocampus in SC Group was much higher than NC Group (P &<0.01)，and EDA group was significantly lower than SC group(P &<0.01). Conclusion: SC maybe increase the expression of JNK， JNK may be mediated to cell apoptosis. EDA can effect the expression of JNK， and lessen the pothology of hippocampus.
Key words: convulsion;brain injury;juvenile rat;JNK;edaravone
惊厥是小儿时期较常见的急症。当惊厥反复发作而未能很好控制时，可导致进行性脑损伤，并可造成认知损害[1]。多种因素导致神经元坏死和细胞凋亡是惊厥性脑损伤的基本原因。JNK(C-Jun N端激酶)是凋亡途径中重要的信号分子，已有部分学者对其参与神经元凋亡的情况做了研究。然而在惊厥持续状态(status convulsive，SC)后的表达情况目前尚未见相关报道。依达拉奉(edaravone，EDA)对低氧缺血性脑病的神经元保护作用已得到证实[2]，但其对于SC后JNK的表达及神经元凋亡的影响情况，国内外尚未见报道。本实验通过建立氯化锂-匹鲁卡品SC大鼠模型，观察幼年大鼠海马p-JNK蛋白及JNK1 mRNA表达的变化，及依达拉奉对SC后海马JNK表达及神经元凋亡情况的影响，初步探讨JNK与惊厥性脑损伤的关系及依达拉奉在SC幼鼠中可能的神经元保护机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物和试剂 清洁级健康幼年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(购自中国科学院上海分院试验动物中心)120只，体重50～70 g。氯化锂、匹罗卡品购自美国Fluka公司，细胞凋亡检测试剂盒购自美国罗氏公司。鼠抗p-JNK单克隆抗体购自美国Stancru公司。M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司，依达拉奉由南京先声东元制药有限公司资助。
1.2 实验分组和SC动物模型的建立 随机将SD大鼠分为正常对照组(NC组)、惊厥持续状态组(SC组)、依达拉奉组(EDA组)三大组，每组40只大鼠;各大组再随机分为5小组，分别于惊厥后4、12、24、48和72 h处死。若因模型不成功、死亡造成各亚组样本量不足8只的，按随机原则补足。采用氯化锂-匹鲁卡品法制作SC模型。SC模型制作参照胡越等[3]方法。惊厥按Racine分级标准分为V级，惊厥发作达到IV-V级，持续时间至少30 min，惊厥解除后状态良好的大鼠为合格SC大鼠模型。NC组：不作任何处理。EDA组：造模前3 d予EDA 3 mg/kg腹腔注射，每天注射一次，连续3 d，其余用药同SC组。
1.3 动物标本的制备 大鼠分别于惊厥后各时间点处死。经10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉后，断头剥离颅骨，完整取出脑组织置于冰盘上，分离右侧海马脑组织，放入去RNA酶的EP管中，迅速置于液氮中保存。左侧大脑在垂直视交叉处离断，并冠状位向后切取约5 mm，放入预冷的4%多聚甲醛固定12 h，入70%乙醇，送病理科进行石蜡包埋;石蜡包埋后制片，切片厚度为5μm。
1.4 实验方法
1.4.1 TUNEL检测凋亡细胞：具体操作步骤参照试剂盒说明书。二氨基联苯胺(DAB)显色，中性树脂封片。结果判定：细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞;光镜下每组各选阳性细胞最集中的5个高倍视野，计算出每个高倍视野的阳性细胞数，取其平均值。
1.4.2 免疫组织化学检测p-JNK蛋白表达：石蜡切片融蜡水化后，用EDTA进行抗原修复，滴加50μL鼠抗p-JNK抗体(1:100)4 ℃过夜后滴加二抗，DAB显色，中性树脂封片。显微镜下观察，阳性细胞为胞核中出现棕黄色。每张切片随机选择5个镜下视野(×200)，应用image-pro plus 6.0图像分析软件测定阳性部位的平均光密度(optical density，OD)，以代表阳性部位的蛋白表达水平。
1.4.3 RT-PCR技术检测JNK1 mRNA表达：①引物设计和合成。检索GenBank数据库中rat JNK1、GAPDH的mRNA序列，利用primer premier 5.0软件设计引物，然后经过Blast匹对，由上海生工生物工程有限公司合成，用前法稀释成10 pmol/μL，引物序列及预期PCR产物长度如下(见表1)。②总RNA的提取。采用Trizol一步法抽提海马总RNA提取，一切操作步骤均按Trizol试剂盒说明书进行。③cDNA的合成。应用M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒，一切步骤均按说明书进行。④PCR。采用单基因扩增法，配制20μL PCR反应体系，然后经PCR扩增，PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃复性30 s，72 ℃延伸40 s，34个循环，最后经72 ℃延长8 min。以GAPDH为内参照。⑤图像分析。产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳后，用FR-980生物电泳图像分析系统获取凝胶图像，观察分析JNK1 mRNA的转录情况，测定PCR产物电泳条带扫描灰度值。以GAPDH作为内参照进行半定量分析比较，以其比值进行统计学分析。
1.5 统计学处理方法 多组比较采用单因素方差分析，均数的两两比较采用LSD-t检验，两变量的相关采用直线相关分析法分析。
2 结果
2.1 各组大鼠海马CA1区TUNEL阳性细胞表达结果(见图1) TUNEL结果显示，TUNEL阳性细胞主要在神经元及神经胶质细胞，胞核中出现棕黄色颗粒，形成典型的“指环状”或“半月状”的细胞凋亡特征。SC组海马CA1区TUNEL阳性细胞于惊厥后4 h已有少量表达，48 h达高峰，之后有下降趋势;其24、48、72 h三个时间点均明显高于NC组(P &<0.01)。EDA组24、48和72 h时间点TUNEL阳性细胞表达水平较SC组均明显降低(P &<0.01);但仍高于NC组(P &<0.01)(见表2)。
2.2 大鼠海马p-JNK蛋白免疫组化结果(见图2) 免疫组化结果显示，NC组p-JNK蛋白在神经元和神经胶质细胞的胞核少量表达。SC后4 h海马CA1区p-JNK蛋白表达即开始增加，48 h达高峰，72 h下降。而EDA组惊厥后各时间点海马p-JNK蛋白表达水平较SC组降低，以24和48 h时间点为著(P &<0.01)(见表3)。
2.3 各组大鼠海马JNK1 mRNA的表达(见图3) RT-PCR方法检测到NC组大鼠海马JNK1 mRNA少量表达。SC组JNK1 mRNA的表达于惊厥后4 h开始增加，48 h达高峰，72 h下降。而EDA组惊厥后24和48 h时间点海马JNK1 mRNA表达水平较SC组均明显降低(P &<0.01)(见表4)。
2.4 相关性分析 大鼠海马CA1区TUNEL阳性细胞与CA1区p-JNK蛋白表达呈正相关(γ=0.567，n=80，P&<0.01)。海马CA1区TUNEL阳性细胞与JNK1 mRNA表达正相关(γ=0.459，n=80，P&<0.01)。
3 讨论
在人类颞叶癫痫患者以及电点燃或化学点燃、局部或系统给予致痫剂等各种癫痫模型中，用形态学或生化的方法均可证实，癫痫发作后，神经元死亡具有典型的凋亡特征[4]。本研究发现，SC后幼年大鼠海马凋亡细胞数在SC后12 h开始升高，48 h达高峰，72 h稍下降，提示氯化锂-匹罗卡品可诱导未成熟脑神经元启动细胞程序性DNA切割成片段;SC后海马神经元发生了细胞凋亡，且以48 h改变最显著，与文献[5]报道基本相符。
JNK又称为应激活化蛋白激酶(stress ac-tivated protein kinase，SAPK)，迄今已发现了由JNK1，JNK2，JNK3的不同剪接形式所组成的10种同源异型蛋白。在受到刺激后，JNK迅速而显著地聚积于核内，并导致相应基因表达改变[6]。众多研究已表明JNK与神经元凋亡密切相关。Xia等[7]在大鼠嗜铬细胞瘤PC-12的培养过程中发现JNK持续激活，PC-12细胞发生凋亡，从而在神经元中首次发现了JNK的促凋亡作用。Cerezo-Guisado等[8]在分析JNK在洛伐他汀导致脑神经细胞凋亡过程中的作用时发现，洛伐他汀诱导了JNK的激活;用JNK的一种选择性抑制剂进行预处理，可以阻止神经母细胞凋亡，从而得出结论，JNK的激活在洛伐他汀诱导的神经母细胞凋亡中发挥了关键的作用。Repici等[9]应用细胞可渗透肽D-JNKI 1(一种特定的JNK抑制剂)抑制JNK活性，从而抑制因大脑缺血引起的神经元凋亡。这些都是JNK参与应激信号转导并介导细胞凋亡的最有力证据。有关脑缺血的研究已证实，由JNK介导的细胞凋亡途径在缺血性脑损伤方面有重要作用。反复惊厥或SC亦可致大脑相对性缺血，但目前对惊厥后JNK的相关性研究甚少。本实验结果显示，SC组海马JNK1 mRNA于惊厥后4 h即开始迅速增加，48 h达高峰，同样p-JNK蛋白于惊厥后48 h达高峰，并在胞核表达;结合本研究TUNEL结果分析，惊厥后凋亡神经元计数高峰位于惊厥后48 h，且大鼠海马CA1区TUNEL阳性细胞数与CA1区p-JNK蛋白表达、JNK1 mRNA表达均呈正相关，从而认为JNK与惊厥后脑损伤密切相关，可能是惊厥后凋亡执行分子之一。
EDA是一种新型的自由基清除剂和抗氧化剂。在脑缺血模型中依达拉奉能减轻脑水肿，延缓神经元死亡，改善神经功能障碍[10]。临床研究结果也表明，依达拉奉在脑梗死中有显著的神经保护作用[11]。然而依达拉奉是否对惊厥后脑损伤有保护作用，相关报道甚少。实验研究表明，SC时脑组织发生缺血低氧，神经元由于缺血低氧会产生大量的氧自由基[12]。而依达拉奉可以通过清除氧自由基、抑制脂质过氧化和调控凋亡相关基因的表达而发挥对神经元的保护作用[13]，由此推测，依达拉奉对惊厥后脑损伤同样有保护作用。本实验发现，匹鲁卡品致痫大鼠预先给予依达拉奉干预，不仅使幼年大鼠海马区p-JNK蛋白和JNK1 mRNA的表达较SC组明显降低，而且使海马区的凋亡神经元数明显减少。这一结果表明EDA对惊厥性脑损伤亦可能有一定的保护作用，其可能通过抑制JNK进而减轻了惊厥所致的脑神经细胞凋亡，具体机制还需要进一步的研究。
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