【摘要】 目的 探讨γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid， GABA)受体阻滞剂普瑞巴林(Pregabalin)对戊四唑(Pentylentetrazol，PTZ)诱导的癫痫模型大鼠神经元损伤的保护作用及其机制。方法 健康SD大鼠38 只，随机分为5 组，对照组、癫痫组和Pregabalin 3 个剂量组(20、40、80 mg/kg)。观察大鼠腹腔注射PTZ前后癫痫发作的情况，同时记录皮层脑电图(electrocoti cogram， ECoG)。应用Western blot电泳分析海马内CA1区P38MAPK及其上游MKK3，下游c-MYC相关蛋白的表达。结果 癫痫组给PTZ后均出现癫痫发作，普瑞巴林组发作程度明显减轻。ECoG潜伏期延长，痫样放电一小时持续时间缩短。同时，与对照组相比，癫痫组和Pregabalin 3个剂量组大鼠CA1区蛋白表达强度升高(P&<0.05);与癫痫组相比，Pregabalin 3个剂量组大鼠CA1区蛋白表达强度降低(P&<0.05)。结论 Pregabalin对PTZ诱导的癫痫大鼠的发作有明显的对抗作用，癫痫大鼠海马具有保护作用，其作用与P38MAPK通路相关蛋白的表达相关。
【关键词】 癫痫;普瑞巴林;痫性发作;皮层脑电图
Pregabalins Influence on Experiment Rats of Caused EpilepsyZHU Jinli1，LIU Xuewen2(1.Liaoning Medical University;2.The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University， Jinzhou 121001 China)Abstract: Objective To explore the effect of GABA receptor blocker Pregabalin to epilepsy rats induced by Pentylentetrazol role model. Methods 38 healthy SD rats were randomly pided into 5 groups， control group， epilepsy group and 3 different dose Pregabalin group (20，40，80 mg/kg). Observe seizures situation of Rats before and after intraperitoneal injection， while recording cortical EEG (electrocoti cogram， ECoG). To analyse the expression of P38MAPK hippocampus area CA1， P38MAPK and upstream MKK3， downstream of MYC-related protein useing Western blot electrophoretic methods. Results Control group all have seizure emerged after PTZ， the degree of attack significantly reduced in the pregabalin group. Incubation period of ECoG extended， the duration of one hour epileptiform discharges shorted. At the same time， compared with the control group， intensity of protein expression in CA1 area of rats increased in epilepsy group and 3 doses Pregabalin groups (P&<0.05).Compared with the epilepsy group， intensity of protein expression in CA1 area of rats decreased in 3 doses Pregabalin groups (P&<0.05). Conclusions Pregabalin has the obvious opposing reaction to the PTZ-induced epileptic seizures in rats and the protective function to seahorse of the epileptic rat. This function is related to the expression of pathway-associated protein.
Key words:epilesy; Pregabalin; epileptic seizure; electrocoti cogram
癫痫是以脑部神经元过度放电所致的突然发生的短暂的中枢神经系统功能失常为特征，表现运动、感觉﹑行为﹑自主神经等的不同障碍。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid， GABA)是中枢神经系统主要的抑制性神经递质，通过位于脑内的GABA受体发挥抑制性作用，在抗癫痫上起重要作用。大量动物实验证实普瑞巴林(Pregabalin)是一种有效的GABA受体的激动剂[1]，据此我们推测Pregabalin可能具有抗癫痫作用。本研究应用戊四唑(Pentylentetrazol， PTZ)快速诱导大鼠癫痫模型，通过行为学观察和脑电图记录研究Pregabalin的抗癫痫作用。并探讨Pregabalin对P38MAPK信号及其上、下游通路的作用。
1 材料和方法
1.1 试剂及仪器
Pregabalin：武汉远城科技发展有限公司，PTZ：美国Sigma公司生产，P38MAKP抗体、c-Myc抗体:武汉博士德生物工程有限公司;MKK3抗体：天津赛尔生物技术有限公司;大鼠脑立体定位仪：VDT-1西北光学仪器厂。
1.2 方法
健康Sprague-Dawley大鼠38 只，雌雄各半，体重210～220 g(辽宁医学院动物中心提供)，单笼饲养，随机分组，对照组6 只，余每组8 只。大鼠麻醉后将其固定与脑立体定位仪上，切开头皮，暴露颅骨，在前囟后7.0 mm﹑正中缝旁开3.0 mm﹑硬膜下0.5 mm，即左右顶叶皮质，用牙科水泥固定两个螺丝，其尾端分别引出一不锈钢电极， 选择前额正中为0电极，分别与前述两电极相连，组成单导联，待测皮质脑电图(ECoG)。将动物随机分为5 组，即对照组、癫痫组和Pregabalin 3 个剂量组(20、40、80 mg/kg)。均固定电极，第二天对照组腹腔注射生理盐水20 min后腹腔注射 PTZ(65 mg/kg)，癫痫组腹腔注射 PTZ(65 mg/kg)和Pregabalin 3 个剂量组(按三个不同剂量)分别腹腔注射Pregabalin 20 min后腹腔注射 PTZ(65 mg/kg)。观察大鼠癫痫发作的情况及EcoG的改变。用Pclab生物信号处理系统进行采集，低速25 mm/s，当出现频发棘波或尖波，棘慢、尖慢复合波，阵发性高波幅时，判定为脑电图癫痫样放电活动，观察癫痫样放电的潜伏期，并分别连续记录腹腔注射PTZ后1 小时内累积癫痫样放电活动持续时间。癫痫发作分级参照acine分级标准[2]。
1.3 Western blot检测P38MAPK表达
急性癫痫大鼠模型制备后2 小时，每组随机抽取半数大鼠，取出海马-70 ℃冰存，经转膜—洗膜—封闭—一抗反应—二抗反应—洗膜显色后用发光法进行X光胶片曝光。然后进行条带扫描和分析P38MAPK及其上游MKK3，下游c-MYC相关蛋白的表达。
1.4 统计学方法
实验结果计量资料均用±s表示，统计分析采用F检验及q检验。P&<0.05作为差异显著性指标，P&<0.01为差异极显著性指标。
2 结 果
2.1 Pregabalin对PTZ致痫大鼠的痫性行为的影响
癫痫组6 只大鼠均出现痫性发作，其发作程度均为5 级;Pregabalin 20 mg/kg组，8 只大鼠均出现癫痫发作，但程度较对照组明显减轻，其中2 只3 级发作，3 只2 级发作，3 只1 级发作;Pregabalin 40 mg/kg组，8 只大鼠1 只未发作，4 只1 级发作，3 只2 级发作;Pregabalin 80 mg/kg组，6 只1 级发作，2 只2 级发作。
2.2 Pregabalin对PTZ致痫大鼠的ECoG的影响
正常大鼠ECoG均以α、β波为主要表现，无明显节律性，波幅40～70 μV，癫痫组观察的6 只大鼠均在给药后很快出现癫痫样放电，潜伏期为(1.41±0.37)min，表现为棘波、棘-慢波，波幅高达200 μV，且癫痫样放电反复出现，1 小时内累计持续时间(27.46±1.13) min，普瑞巴林20 mg/kg组，观察8 只大鼠中均出现癫痫样放电，但潜伏期明显延长，为(6.04±0.83) min，同PTZ组比较有显著性差异(P&<0.05)。1 小时持续时间缩短，为(21.81±2.06) min，波幅150 μV，同PTZ比较未达到显著性差异(P&>0.05)。普瑞巴林40 mg/kg组及普瑞巴林80 mg/kg组，潜伏期进一步延长，分别为(9.82±1.91) min和(12.35±3.74) min，1 小时持续时间进一步缩短，分别为(18.44±1.91) min和(16.67±1.19) min，同对照组比较具有显著性差异，波幅也明显降低，见表1。表1 Pregabalin对PTZ诱导的癫痫大鼠ECoG的影响同PTZ组比较，P&<0.05
2.3 Pregabalin对PTZ诱导的癫痫大鼠脑组织MKK3、P38MAPK、c-MYC蛋白表达的影响
Western blot结果显示，与对照组比较，PTZ组的MKK3、P38MAPK、c-MYC蛋白表达明显增加(P&<0.01);与PTZ组比较，Pregabalin组的MKK3、P38MAPK、c-MYC蛋白表达降低(P&<0.05)，见表2和图1。表2 Western blot MKK3、P38MAPK、c-MYC表达灰度值注：与PTZ组比较，*P &<0.05;与对照组比较，P&<0.01图1 MKK3、p38MAPK、C-MYC的蛋白印记
3 讨 论
癫痫发作的病理生理学基础是各种原因导致的脑神经元异常放电，脑电图是诊断癫痫的最基本、最重要的检查方法。为探讨其发病机制和寻找有效的治疗药物，可通过建立癫痫动物模型，观察行为学的异常，脑电图的改变，兴奋性神经递质的测定，病理学的观察来达到目的。本实验观察了Pregabalin对PTZ导的急性癫痫模型的抗癫痫作用。
Pregabalin化学名为(3S)-3-氨甲基-5-甲基己酸[3]，是GABA受体的拮抗剂， 普瑞巴林是神经递质GABA的一种类似物，能阻断电压依赖性钙通道，减少神经递质的释放。可与中枢神经系统中电压门控钙通道辅助性亚单位(α2-δ蛋白)结合而表现出较高的抗癫痫、止痛和抗焦虑活性。本实验拟从GABA是中枢神经系统的主要抑制剂[4]的角度出发探讨Pregabalin的抗癫痫的作用及其机制。
GABA是中枢神经系统主要的抑制性神经递质，通过位于脑内的GABA受体发挥抑制性作用，中枢神经系统GABA含量降低是神经细胞过度兴奋、诱导同步放电、导致癫痫发作的重要原因之一;GABA是脑内含量较高的重要抑制性神经递质。实验上和理论上都有证据表明GABA能神经传递是神经同步活动的基础。在一些环境中，GABA介导的电位可被去极化，继而引起神经兴奋。Fujiwara Tsukamoto等发现，兴奋性GABA中间神经元和锥体细胞间的谷氨酸回返连接形成正反馈回路，发生同步的癫痫后放电活动。还发现在成年鼠海马CA1区，兴奋性GABA参与癫痫的节律性同步活动，高频的突触刺激可诱发发作后放电。在大鼠海马切片中发现，选择性离子移变拮抗剂谷氨酸受体或GABA 受体和缝隙连接抑制剂完全阻断海马后放电活动。GABAA受体是脑内最普遍的抑制性递质受体，与癫痢的关系最密切。GABAA受体是神经细胞内最常见的抑制性神经递质，是一种配体门控的氯离子通道。GABAA受体激活后打开氯离子通道增加神经元细胞膜Cl-通透性，导致Cl-通道开放，大量Cl-快速内流引起突触后膜超极化，阻抑调控神经元过度放电及突触后易化，产生抑制性突触后电位发挥突触后抑制作用。
癫痫发病机制极为复杂，有钙离子、兴奋性氨基酸及多条信号转导通路参与[5]。其中，MAPK信号通路是目前研究的热点。MAPK信号途径包括ERK1/2p38MAPK、JNK和ERK5 4个成分，是多种细胞外信号引起核反应的细胞内汇聚通路，广泛参与细胞生长、分化、死亡等[6]。
近年来MAPK与癫痫的关系越来越受到重视，MAPK的激活在发作急性期癫痫持续状态、慢性癫痫中都有报道。有学者认为ERK/MAPK途径的激活也是诱导和维持反应性胶质增生的必由之路，并在包括慢性癫痫、脑梗死等的慢性损伤脑组织中检测到ERK/MAPK免疫反应强阳性[7]。以往的多种点燃模型中都发现了癫痫大鼠海马透明层的p38MAPK含量增加，本研究与以上结果一致。
本研究结果显示，PTZ诱导的癫痫大鼠p38MAPK蛋白表达增高，信号转导通路被激活，而Pregabalin预处理后，p38MAPK表达减少，且随着Pregabalin的剂量增加p38MAPK表达逐渐减少，呈现剂量依赖性保护效应，提示p38MAPK通路参与了PTZ诱导的癫痫大鼠发作后的病理过程，GABA受体的阻滞剂Pregabalin可抑制其表达。总之，由此可以看出Pregabalin具有明显的抗癫痫作用，p38MAPK在癫痫后神经元损伤中扮演的角色及其与其他信号通路之间联系意义重大，它将为癫痫的治疗开辟新的视角和调控位点。
参考文献
1] 陈敖，张建军.新药普瑞巴林的合成[J]. 精细与专用化学品， 2005，13(10):14-17.
[2] Racine RJ. Modification of Seizure activety by electrical stimulation:II.Motors seizure[J]. Electroencephalogr clin Neurophysiol，1972，32(3):281-294.
[3] 张桂森，杨相平，刘笔锋. 普瑞巴林的合成[J]. 中国医药工业杂志，2007， 38(9):617-619.
[4] 张新定，裘明德.氨基丁酸系统与癫痫[J].兰州大学学报(医学版)， 2006， 93 (4):93-96.
[5] Jiang Y，Gram H，Zhao M，et al.Characterization of the structure and function of the fourth member of p38 group mitogen activated protein kinase p38 delta[J]. J Biol Chem，1997，272(48):30122-30128.
[6] Harrison JC，Zyla TR.S ress specific activation mechanisms for the“cell integrity” MAPK pathway[J].Biol Chem，2004，279(4):2616.
[7] Zhu Y，Culmsee C，Klumpp S，et al.Neuroprotection by transforming growth factor-beta l involves activation of nuclear factor-kappa B through phosphatidylinositol-3-OH kinase/Akt and mitogen-activated protein kinase- extracellular-signal regulated kinase1， 2 signaling pathways[J].Neuroscience，2004，123(4):897-906.