【摘要】 目的 研究血管生成素-1(Ang-1)对糖尿病大鼠早期视网膜微血管渗漏、及血管细胞凋亡的影响，并探讨其作用机制。方法 应用链脲佐菌素(STZ)制备SD大鼠糖尿病模型。只随机分为6 组：糖尿病3 月组(DM3)、6 月组(DM6)，Ang-1治疗3 月组(ANG3)、6 月组(ANG6)及正常对照3 月组(CON3)、6 月组(CON6)。ANG组大鼠每只眼球球后注射Ang-1溶液0.05 mL/15 d(4 μg/mL)。各组大鼠到期后，尾静脉注射异硫氰酸葡聚糖，制备视网膜血管铺片;免疫组化法定量检测视网膜VEGF的表达;蛋白印迹法定量检测视网膜Survivin的表达量。所得数据应用SPSS软件包进行统计学分析。结果 DM3组大鼠视网膜毛细血管扭曲、不规则，可见无灌注区，ANG3组可见明显的改善。DM6组毛细血管末端出现了“芽孢”样的增生，ANG6组并未发现。视网膜VEGF的表达量DM组显著增高，与CON组比较差异具有高度显著性(P&<0.01)，ANG组较DM组表达量有所减少，差异有显著性(P&<0.05)。大鼠视网膜Survivin蛋白CON组无表达，ANG3组表达量高于DM3差异有高度显著性(P&<0.01)，DM6与ANG6组间差异无显著性(P&>0.05)。结论 Ang-1抑制糖尿病大鼠视网膜毛细血管的渗漏，并抑制糖尿病大鼠视网膜VEGF表达量的升高;可阻止糖尿病大鼠视网膜毛细血管细胞凋亡。
【关键词】 糖尿病视网膜病变;微血管渗漏;血管生成素-1;凋亡
Abstract： Objective The paper aims to explore the effect of Ang-1 on retina vascular permeability and endothelial cell apoptosis in vivo and in-vitro environments and to approach the mechanism of action.Methods Animal models were induced by streptozocin (60 mg/kg weight) on Sprague-Dawley rats and randomly pided into DM3， DM6， ANG3， ANG6 group and control group (CON).ANG group rats were intraocular injected with Ang-1 0.05mL (4 μg/mL) every fifteen days. After 3 to 6 months， every rat was injected with 55 mg Flurorescein isothiocyanate-dextran through caudal vein. The retinal try sin digests were prepared. The quantity of VEGF on the retina was assayed by Immune-histology and the quantity of Surviving was assayed by Western-blotting. Two animals of each group were killed after 3 months and 6 months respectively. The data obtained were by statistically assessed.Results DM3 group showed retinal capillary becoming distortion and irregularity， area of no perfusion while ANG3 group got amelioration obviously. DM6 group showed spring proliferation in the end of the capillary， while ANG6 did not show such phenomenon. DM group showed higher quantity of VEGF than CON group (P&<0.01)， while ANG group showed lower quantity of VEGF than DM group (P&<0.05). CON group showed negative of Surviving， ANG3 group showed higher quantity of surviving than DM3 group (P&<0.01)， while DM6 group and ANG6 had no significant difference (P&>0.05). Conclusions Ang-1 can inhibit the diabetic retinal capillary leakage in early diabetes rats and inhibit the high levels of VEGF and the frequency of early apoptosis in retinal capillary cells as well.
Key words： diabetes retina pathological change; capillaries' leakage; Angiogenin-1; wither
糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)，是糖尿病最为常见和严重的微血管并发症之一，已成为成人目致盲的主要因素，因其缺乏有效的治疗方法，因此DR一直成为困扰眼科医生的疑难病症。关于DR的发病机制有很多学说，如糖基化终产物学说、自由基和氧化应激学说、多元醇代谢途径学说、凝血功能异常学说等，DR的病理改变早期就有微血管渗漏，微血管病变是DR发病的基本环节，研究表明，血管生成素(Angiopoitein，Ang)与内皮细胞受体Tie-2结合调节成熟个体新生血管生成，具有稳定血管壁的作用。周细胞维持血管稳定性是通过与内皮接触并表达Ang-1来实现的。Thurston G认为Ang-1可以通过抑制由炎症或VEGF诱导的血管渗漏。他进一步应用Ang-1抗血管渗漏获得成功，且无血管形态的异常。本实验通过建立STZ糖尿病大鼠模型，并选择Ang-1干预治疗，判定其对糖尿病大鼠视网膜毛细血管细胞凋亡以及视网膜血管病变的影响，为DR早期的药物治疗提供新的方向。
1 材料和设备
1.1 材料
S-D大鼠 (辽宁医学院动物实验中心提供)，STZ(Merck-Calbiochem)，Ang-1(sigma公司 )，FITC(sigma公司 )，VEGF免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，SABC(兔IgG)-POD试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，Survivin(1-142)(Santa Cruz公司)。
1.2 设备
One-Touch-Ⅰ型血糖仪(美国强生公司)，光学显微镜及照相机(日本OLYMPUS)，透射电镜(日本1200EX)，CIAS-1000图像分析系统(北京恒大图像图形研究所)，微波炉(日本松下)，荧光显微镜(日本OLYMPUS)。
2 实验方法
2.1 动物分组及模型的制备
选体重200～250 g雄性SD大鼠60 只。随机分为两组，40 只大鼠以55 mg/kg体重一次性尾静脉注射2%STZ溶液，以0.5 mmol/L的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液(pH = 4.5)配制，另20 只作为对照组注入等量容积上述缓冲液。当天即让大鼠自由进食水，不限量。注射后48～72 h测血糖及尿糖，将血糖浓度大于16.7 mmol/L、尿糖阳性者定为糖尿病大鼠。然后将糖尿病大鼠随机分为4 组，糖尿病3月组(DM3)、6月组(DM6)、Ang-1治疗3月组(ANG3)、6月组(ANG6)。每组各10 只大鼠。ANG3组自成模1月起、ANG6组自第4月起每15 d球后注射将Ang-1，(溶于pH=7.2、甘油浓度为5%的浓缩PBS中，浓度为4 μg/mL。)相应DM组注射不含药物的PBS。单个眼球用量为0.05 mL。饲养3个月及6个月后取材。
2.2 异硫氰酸葡聚糖荧光素视网膜血管造影
各组动物到期后，乙醚麻醉取异硫氰酸葡聚糖荧光素50 mg心内注射。摘除眼球，行视网膜铺片，荧光显微镜观察。
2.3 视网膜石蜡切片制备
取大鼠眼球，固定于4%多聚甲醛(4 ℃ 12 h)中，流水冲洗24 h，然后于距齿缘后0.5 mm处剪开眼球壁，去除眼前节和玻璃体。余下眼杯入酒精逐级脱水，二甲苯透明，浸蜡，全层石蜡包埋，制作5 ～7 μm切片。
2.4 石蜡切片免疫组织化学染色
VEGF免疫组织化学检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，实验操作均按试剂盒使用说明书进行。
2.5 VEGF表达灰度值的测量
各组有VEGF表达的切片CIAS-1000图像分析系统分析，每张切片随机选择10个视野，测出灰度值
2.6 Western blotting检测Survivin蛋白表达
各组大鼠动物到期后，10%水合氯醛麻醉处死取双侧视网膜组织，采用Western blotting法提取组织和细胞内蛋白质样品，Bradford法测定浓度，在120 g/LSDS-PAGE凝胶中进行电泳分离后，电转移法将蛋白质转移至PVDF膜。PVDF膜在含50 g/L脱脂奶粉的TTBS缓冲液中
2.7 统计学分析
采用单因素方差分析以及两样本比较的q检验， 用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析。
3 结 果
3.1 异硫氰酸葡聚糖荧光素视网膜血管造影
CON组正常视网膜微血管管径粗细均匀一致，大血管向四周放射状均匀分布，行走规则(图1A)。DM3组视网膜血管扭曲和不规则，可见毛细血管无灌注区(图1B)。ANG3组未见明显的毛细血管网的紊乱。DM6已经出现毛细血管的芽孢状增生，具体表现为荧光素的集中表达形成亮点(图1C)，随着病程的进展则会出现毛细血管的渗漏。ANG6未见到明显的毛细血管的增殖与渗漏。
3.2 各组大鼠视网膜组织VEGF的表达
VEGF表达的阳性细胞为细胞浆着淡黄色至棕褐色颗粒。CON组VEGF蛋白微弱表达于神经节细胞层、内核层的某些细胞和外核层(图2A)。DM3组VEGF蛋白表达在内核层、神经节细胞层和突破视网膜内界膜的新生血管(图2B)。DM6组大鼠VEGF视网膜表达量明显增加，新生毛细血管的内皮细胞突破内界膜的数目呈增多的趋势(图2C)。相应的ANG组表达量降低(图2D、图2E)。
3.3 各组大鼠视网膜组织VEGF的灰度值的测定
各组大鼠视网膜组织VEGF免疫组化的切片用图像分析仪测定灰度值，病程3月、6月时分别为(93.1667±2.4740)、(80.9998±2.7523)，与CON组(119.2398±2.0669)(124.8205±1.9615)相比差异具有显著性(P&<0.05、P&<0.01)。ANG组3月、6月时分别为(115.8548±1.3431)、(92.8509±2.2234)，与相应DM组相比差异具有高度显著性(P&<0.01)(表1)。表1 VEGF蛋白表达灰度值(-(-表)±s，n=50)**P&<0.01 *P&<0.05，与DM组比较 △P&<0.05，与CON组比较#P&<0.05
3.4 Westen blot检测大鼠视网膜组织Survivin蛋白的表达
CON组大鼠视网膜组织无表达，DM、ANG各组都有表达(图3、图4)。DM6表达比较DM3表达有增强趋势，但是组间比较无显著性差异(P&>0.05)。ANG3表达含量增加相较于DM3有显著性差异(P&<0.05)。ANG6比较于DM6有减少的趋势，但没有显著性差异(P&>0.05)，无统计学意义。
4 讨 论
DR的发展经历了NPDR和PDR两个阶段。由于NPDR先于PDR出现并直接造成PDR，故从细胞和分子水平深入研究NPDR的病变过程，对于制定早期防治策略，具有更重要的现实意义。NPDR眼底表现为微血管瘤、出血斑、棉絮斑、硬性渗出及小的毛细血管无灌注，最后小的毛细血管闭塞，形成无细胞毛细血管，无细胞毛细血管增多可造成视网膜缺氧。PDR表现为毛细血管无灌注区扩大，视网膜大片血管闭锁，严重缺血缺氧，刺激组织的各种生长因子，最后形成新生血管。由于新生血管内皮的不完整性，又易出血、缺氧，刺激新生血管形成，并出现纤维增殖，造成严重的视力障碍。这些病变导致视网膜缺血缺氧和VEGF上调，VEGF含量增高，一方面促进微血管内皮细胞增生，另一方面又使细胞通透性增强，大分子物质如纤维蛋白原等进入细胞外基质中。形成纤维蛋白凝胶，允许和支持新生血管和基质细胞的内向生长，最终导致新生血管形成。DR的“无灌注区”形成与视网膜毛细血管细胞凋亡加速发展有密切关系。刘学政等亦证实了在视网膜周细胞凋亡的同时，内皮细胞亦出现凋亡。糖尿病时内皮细胞和周细胞凋亡加速发生，血管细胞大量丢失是微血管瘤和“无灌注区”发生的基础，因而血管发生闭塞，视网膜缺氧。Survivin是迄今为止作用最强的凋亡抑制因子。Survivin阻抗细胞凋亡的位点在细胞色素C从线粒体向胞质释放的下游，与末端效应酶Caspase-3和7特异地结合，从而抑制Caspase-3、7酶原的激活。Survivin的高表达可抑制多种因素诱导的细胞凋亡，如抑制Fas、bax、Caspase及抗癌药物所诱导的细胞凋亡。
本实验在建立STZ糖尿病大鼠模型同时，给予Ang-1治疗。从实验中发现，通过对ANG组大鼠视网膜形态学观察，发现从光镜毛细血管形态结构，还较DM组有明显地改善。这些实验数据鉴定了Ang-1的多种新的生物活性，Ang-1有效的抑制了VEGF在糖尿病视网膜中的表达，这些改变肯定伴随着Akt激酶(VEGF活化的一种介质)活性的降低，同时也应该会有视网膜一氧化氮合酶和一氧化氮(促进VEGF诱导ICAM-1表达和白细胞粘附的介质)的减少。尽管Ang-1在体外能激活视网膜内皮细胞Akt激酶的活性，但在体内情况却复杂的多。Ang-1对Akt、一氧化氮合酶和一氧化氮、以及VEGF抑制的间接效果似乎比它对这些分子的直接效果重要的多。在宏观水平，通过荧光造影的观察，DM3有无灌注区的出现，DM6毛细血管出芽增生及其伴随的整个眼底毛细血管网的紊乱，相应的ANG组视网膜组织都有明显的缓解。Ang-1能抑制糖尿病血管-视网膜屏障的损伤和保护糖尿病视网膜血管免受白细胞介导的内皮细胞损伤和死亡，实验数据也表明糖尿病大鼠模型，观察视网膜组织内Survivin的表达水平CON组无表达，DM3、DM6两组100%表达说明大鼠机体内反馈性调节抑制各类型细胞凋亡。DM3、DM6两组的表达水平相当说明机体的反馈调节能力也是有限的。有研究表明，Ang-1在Survivin作用下其表达上调。本实验借助动物模型采用外用Ang-1干预的治疗方法，使得Survivin表达上调，进一步说明了两者在机体内相辅相成的作用。本研究说明Ang-1可以通过上调Survivin的表达，抑制血管内皮细胞和周细胞的凋亡，同时Ang-1可以拮抗VEGF对糖网病视网膜血管内皮的损伤作用，进而减少微血管的渗漏而发挥保护糖尿病视网膜的病理损伤作用的。
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