作者：王雪峰 ， 张莉，杜晓媛，梁雯，远洋
【摘要】 目的 研究负载人喉癌细胞系Hep-2冻融抗原的树突状细胞(DC)体外活化的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在裸鼠Hep-2移植瘤发生、发展中的作用。方法 以健康人外周血贴壁单核细胞体外诱导DC并负载Hep-2冻融抗原，经MTT法检测其激活的同基因型T淋巴细胞在体外对Hep-2的杀伤活性后，将此Hep-2特异性CTL预防性接种于裸鼠皮下(预防组6 只，对照组16 只)，3 天后接种Hep-2，观察其移植瘤的发生率：再将此CTL分以1 次、2 次治疗性接种于已荷瘤裸鼠皮下(对照组6 只;治疗组和加强治疗组各5 只)，观察移植瘤的生长情况。结果 预防组Hep-2移植瘤的发生率明显低于对照组(预防组33%，对照组00%，P=0.0002);治疗组与加强治疗组裸鼠荷瘤体积明显小于对照组(P&<0.05，P&<0.01)，且加强治疗组裸鼠荷瘤体积明显小于治疗组 (P&<0.05)。结论 负载Hep-2冻融抗原的DC活化的CTL不仅能预防裸鼠Hep-2移植瘤发生而且能抑制其移植瘤的生长。
【关键词】 树突状细胞;肿瘤免疫治疗;喉癌;裸鼠
Abstract： Objective To study the effect of the cytotoxic T lymphocyte (CTL)activated by dendritic cell (DC) loaded with human laryngeal carcinoma cell line Hep-2 lysates on the Hep-2 implanted tumor occurrence and its growth in nude mice.Methods In vitro DC was induced by monocyte isolated from human peripheral blood mononuclear cells and loaded with antigens from Hep-2 tumor lysates. Also in vitro the efficacy of killing Hep-2 cell with Allogeneic T lymphocyte activated by DC was examined through MTT. In vivo the tumor occurrence rate of nude mice previously subcutaneously injected the specific CTL (6 from precaution group， 16 from control group) and its growth among the 16 Hep-2 implanted tumor nude mice treated by specific CTL once or twice were observed (6 from control group， 5 from treatment group and 5 from retreatment group respectively). Results Within 20 days the tumor occurrence of the precaution group was significantly reduced compared to that of the control group (p-0.0002); the Hep-2implanted tumor size of the treated and retreated group were significantly inhibited (P&<0.05，P&<0.01) compared with the control group， and the retreated was more significantly than the treated (P&<0.05).Conclusions The CTL activated by DC loaded with antigens from Hep-2 lysates can not only protect the nude mice against the challenge of Hep-2 cell but also inhibit the growth of the Hep-2 implanted tumor in nude mice.
Key words：dendritic cell; tumor immunity; laryngeal carcinoma; nude mice
树突状细胞(dendritic cell，DC)是目前已知功能最强的专职抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)，它因能刺激并致敏初始T细胞和启动早期免疫反应而在肿瘤免疫治疗中占有重要的地位。国内、外已有实验应用DC疫苗治疗一些恶性肿瘤并获得初步肯定，但在治疗喉癌方面尚未见有报导。本实验研究以Hep-2抗原负载的DC在体外激活同基因型T淋巴细胞产生的特异性CTL，能否直接在体内预防裸鼠Hep-2移植瘤的发生和抑制其移植瘤的生长，为进一步探讨DC疫苗用于临床治疗喉癌提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物与细胞
裸鼠BALB/C22只，雌性，4～6周龄，(20±2)g，购于中国医科大学SPF级动物实验中心。人喉癌细胞系Hep-2购自北京耳鼻咽喉研究所;健康人新鲜外周血购自锦州市中心血站。
1.2 主要试剂及仪器
完全培养基：RPMI-1640(GIBCO公司)、20%胎牛血清(FBS)、2 mmol/L谷氨酰胺、20 mmol/L HEPE是(SIGMA公司)、l mmol/L丙酮酸纳、100 U/mL青霉素、80 U/mL庆大霉素：rhGM-CSF(华北制药厂)，rhIL-4、rhIL-2 (BIO公司)，rhTNF-α(EC公司);淋巴细胞分离液(天津)，尼龙毛 (上海);四氮唑蓝盐(MTT)(华美生物公司);小鼠抗人CD83McAb(深圳裕盛佳公司)，S-P免疫细胞化学染色试剂盒(迈新生物公司)。WJ-6C。二氧化碳孵育箱(日本)，DG3022A型酶联免疫检测仪(华东电子管厂)。
1.3 肿瘤细胞冻融抗原的制备
收集处于对数生长期的Hep-2肿瘤细胞，用生理盐水洗2 次，制成浓度2×108/mL，反复冻融(-70 ℃/37 ℃)4 次，2 000 r/min离心1 h取上清，过滤除菌，4 ℃保存备用。
1.4 DC的诱导与鉴定
取健康人新鲜外周抗凝血，用Fic。11不连续密度梯度离心法分离获得单个核细胞，低渗裂解红细胞，PBS洗去血小板，以含20%FBS的RPMIl640调整细胞浓度至1×107/mL，取5 mL加入T-25塑料培养瓶，37 ℃，5%CO2孵箱培养2 h后，吸除未贴壁细胞即获贴壁单核细胞，加入完全培养基、rhGM-CSF 1 000 U/mL、rhIL-4 1 000 U/mL常规培养，每2 d换液1 次。第四天将细胞分为2 组：负载组另加Hep-2冻融抗原5×106/mL (抗原量以冻融前Hep-2细胞数计)、rhTNF-α200 U/mL;未负载组不加冻融抗原，继续培养4 d，收集悬浮细胞，部分用完全培养基重悬浮备用：余用小鼠抗人CD83McAb以S-P免疫细胞化学染色法鉴定。
1.5 CTL的体外诱导及活性检测
取与DC来源相同的新鲜外周抗凝血，同上法用含20%FBS的RPMIl640调整单个核细胞浓度小于1×108/mL，注入自制的T细胞尼龙毛柱，37 ℃温育1 h后用上述培养基冲洗出非粘附细胞即为T淋巴细胞;将其分与两组DC按10：1的比例混合，加含IL-2 1 000U/mL的完全培养基，37 ℃，5%CO2孵箱培养72 h，分收集细胞(CTL)。用含10%FBS的RPMI-1640重悬细胞，将各效应细胞(负载组的特异性CTL、未负载组的非特异性CTL和单纯T细胞，5×104/孔)与靶细胞(处于对数生长期的Hep-2细胞5×103/孔)按效靶比10：1混合，置于96 孔平底培养板中(0.2 mL/孔);同时分设效应细胞(5×104/孔)与靶细胞(5×103/孔)平行对照孔(0.2 mL/孔)，每组复设5 孔，37 ℃，5%CO2孵箱培养72 h后，加入5 mg/mLMTT溶液0.2 mL继续培养4 h，离心沉淀、去上清、无水乙醇溶解，用酶联免疫检测仪在波长570 nm测各孔光密度值(OD)，计算效应细胞对靶细胞的杀伤率：杀伤率二(靶细胞OD值+效应细胞OD值—效靶细胞杀伤反应后OD值)/靶细胞OD值×100%。
1.6 制备接种液
分取处于对数生长期的Hep-2细胞和Hep-2抗原特异性CTL，PBS (pH7.2)洗2 次(1 000 rpm/min)再重悬，经台盼蓝拒染法检测细胞活性均大于95%，PBS调整细胞浓度5×106/mL。
1.7 预防裸鼠Hep-2移植瘤的发生
将22只裸鼠随机分组：预防组(6 只)于裸鼠右侧背部皮下接种0.2 mL特异性CTL(1×106)，对照组(16只)以0.2 mL生理盐水作对照：3天后于两组裸鼠左侧背部皮下接种0.2 mL Hep-2(1×106)，每天观察1 次其移植瘤发生情况，直到接种Hep-2后第20 d，处死预防组裸鼠。
1.8 抑制裸鼠Hep-2移植瘤的生长
将上述成瘤后的对照组随机分成3组：治疗组(5 只)在第18 天于右侧背部皮下接种0.2 mL特异性CTL作治疗，加强治疗组(5 只)在第18、24 d 2 次作上述治疗，对照组(6 只)在第18、24 d注射0.2 mL生理盐水作对照;每天观察1 次其移植瘤生长情况，直到第39天处死裸鼠，记录肿瘤正交直径(mm)，计算其体积(mm3)=长×宽2/2。
1.9 统计学方法
两组间的计量资料比较采用t检验，在三组间比较用单因素方差分析及q检验。计数资料采用四格表确切概率法。实验所得数据均以-(-所)±s表示，P&<0.05具有统计学意义。
2 结 果
2.1 鉴定成熟DC人外周血贴壁单核细胞体外诱导7 d，抗原负载与未负载组的DC在形态上无明显区别，大部分悬浮生长，具有树突状突起呈毛刺状、星状、蝌蚪状、梭形等(图2)，经S-P免疫法鉴定，CD83+阳性率均达80%以上(图3)，显示已分化成熟。
2.2 MTT法检测特异性CTL杀伤活性
见表1，与对照组相比：特异性、非特异性CTL组瘤细胞活性明显降低(P=4.5×10-8、P=4.5×10-5)，而单纯T细胞组瘤细胞的活性无明显改变(P=0.47);特异性CTL对Hep-2细胞的杀伤率明显高于非特异性CTL(P=5.6×10-8)。镜下见：特异性C几组瘤细胞呈圆形，散在分布，T细胞呈花环状或簇状聚集在瘤细胞周围(图4);对照组瘤细胞呈多角形贴壁伸展，片状分布(图5)。表1 DC激活的T细胞对Hep-2细胞的杀伤作用(-(-的)±s，n=5)注：与对照组相比*P&<0.01：与非特异性CTL组相比#P&<0.01
2.3 特异性CTL预防裸鼠Hep-2移植瘤的发生
预防组裸鼠接种Hep-2细胞后20 d内有2 只发生移植瘤，其发生率为33%：而对照组裸鼠于接种后8 天内即有移植瘤发生，14 d内16 只均发生移植瘤，其发生率为100%，预防组移植瘤发生率明显降低 (P=0.0002)。
2.4 特异性CTL抑制裸鼠Hep-2移植瘤的生长
按裸鼠接种Hep-2后其移植瘤体积变化绘出生长曲线(图1)，结合数据显示：治疗组裸鼠荷瘤第18 d给予一次特异性CTL治疗后，其第2l、24、27、30、33、36、39 天瘤体积明显小于对照组(P&<0.05);加强治疗组裸鼠于第18、24 d2 次给予特异性CTL治疗，其第24、27、30、33、36、39 d瘤体积明显小于对照组(P&<0.01)，且其第30、33、36、39天其瘤体积明显小于治疗组(P&<0.05)。表2 特异性CTL对裸鼠移植瘤的治疗效果注：与对照组相比*P&<0.05，与治疗组相比#P&<0.05
3 讨 论
宿主对肿瘤的排斥依赖于高效而特异的抗肿瘤免疫反应，尤其是T细胞免疫，而在荷瘤宿主体内由于APC功能存在缺陷，特别是DC的数量、功能和形态学的改变可使DC表面分子表达抑制和DC功能发生缺陷，甚或有些肿瘤引起DC凋亡，从而阻断了T细胞特异性抗肿瘤反应的发生。研究表明，负载肿瘤抗原的DCs能协调肿瘤抗原，在体内、外有效地诱导T淋巴细胞介导的抗肿瘤作用，可使T细胞增殖、活化，通过活化因子的作用，产生高效、特异性杀伤肿瘤细胞的CTL，从而抑制肿瘤的发生与发展。目前，研究者多以DC疫苗的制备，进行免疫疫苗的实验，以尝试免疫治疗的研究。张莉等就用健康人外周血贴壁单核细胞体外诱导出功能正常的DC，并以负载喉癌(Hep-2)细胞冻融抗原的DC在体外诱导出高效而特异的抗喉癌免疫，本实验利用BALB/C裸鼠T淋巴细胞免疫缺陷的特性，进一步观察诱导出的特异性CTL在裸鼠体内的抗喉癌移植瘤效应，为临床应用DC疫苗免疫治疗喉癌及预防肿瘤复发提供理论实验依据。
实验中，裸鼠因预防性的输入了特异性CTL，预防组20天内移植瘤的发生率明显低于对照组(P=0.0002)，提示机体在没有T细胞免疫监视时易于发生肿瘤，而经Hep-2抗原负载DC诱导的特异性CTL可明显抵抗Hep-2细胞对裸鼠的攻击，预防Hep-2移植瘤的发生。对已荷瘤裸鼠，治疗组与加强治疗在输入特异性CTL后，移植瘤的生长受到明显抑制，且加强治疗组受到的抑制比治疗组更明显;生长曲线进一步显示，在治疗组经一次CTL治疗后，这种抑制作用持续约1 w就逐渐减弱，而在加强治疗组，由于及时补充有效剂量的CTL这种抑制作用持续的时间延长，减弱趋势延缓。这与输入到裸鼠体内的肿瘤抗原特异性CTL主要通过程序性死亡和渗透性致死的杀伤机制来抑制肿瘤的发生与生长有关。
在此过程中CTL自身并无损伤，可继续杀伤瘤细胞，但CTL在裸鼠体内有一定的生存期且无继续增殖的条件，故其在裸鼠体内是逐步衰减的。综上分析说明，要取得较好的抑制肿瘤生长的效应最终需要的是抗原特异性CTL和其有效剂量的维持，从而进一步证实负载肿瘤抗原的DC能有效地启动T细胞以抗原特异的形式识别和杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的发生与生长。
在喉癌患者体内有丰富的T淋巴细胞，包括处于非激活状态的肿瘤浸润性T淋巴细胞，设想应用负载喉癌抗原的DC疫苗就能在体内诱导出类似于体外产生抗原特异性CTL的主动免疫反应，将喉癌抗原有效地提呈给体内T淋巴细胞并使其大量增殖活化，从而发挥高效而特异的抗喉癌免疫，达到肿瘤免疫治疗的效果。尽管肿瘤患者体内T细胞缺陷或受到抑制致使功能低下，使TCL功能下调，但是，如果通过基因修饰、活化细胞因子等构建新型融合疫苗，通过不同途径激活T淋巴细胞，诱导产生的TCL的活性大大提高，增强了免疫杀伤作用，这将为喉癌患者免疫治疗提供了新的思路，具有很好潜在的临床应用价值。
(此文图2-5见第384页)
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