作者：李丹，张锋雷，李任锋，王艳杰，王德山
【摘要】 目的 观测匹维溴胺对腹泻型肠易激综合征(diarrhea-prodominant irritable bowel syndrome，D-IBS)模型大鼠结肠组织P物质(SP)含量及表达变化影响，探讨匹维溴胺治疗D-IBS机制。方法 采用应激与束缚相结合的方法复制D-IBS动物模型后，应用ELISA、免疫组化方法检测结肠组织SP含量及表达。结果 与正常组比较，模型组大鼠结肠组织SP含量及其表达明显增高;与模型组比较，匹维溴胺组大鼠结肠组织SP含量及其表达明显降低。结论 匹维溴胺治疗D-IBS模型大鼠的疗效与SP含量及其表达下调有关。
【关键词】 肠易激综合征;腹泻型;匹维溴胺;P物质
Effects of Pinaverium Bromide on SP Content of Colon Tissue in Rats withDiarrhea-predominant Irritable Bowel SyndromeLI Dan，ZHANG Fenglei，LI Renfeng，WANG Yanjie，WANG Deshan(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine college of Basic Medicine， Shenyang 110032 China)Abstract：Objective To observe the effects of the Pinaverium bromide on substance P (SP) content of colon tissue in rats with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome(D-IBS) in order to explore mechanism of action the Pinaverium bromide on D-IBS. Methods D-IBS animal model was established by stress combined with constraint， detect SP content and expression by immunohistochemistry and ELISA method in colon tissue. Results Model rats compared with normal group SP were significantly elevated in colon tissue， Pinaverium bromide group compared with model group， SP were significantly lower in colon tissue. Conclusions Pinaverium bromide acts to treat D-IBS maybe connected with reducing SP in the colon tissue.
Key words:irritable bowel syndrome;diarrhea-predominant;pinaverium bromide;substance P
IBS是一种严重影响人类生活质量的功能性疾病，其病因及发病机制至今尚未完全阐明，近年来脑肠互动的发病模式和神经内分泌网络的发病机制正成为研究的热点。SP作为重要的脑肠肽之一，在胃肠道的分泌和运动中起极其重要的作用。本研究通过观测肠道钙离子拮抗剂匹维溴胺对D-IBS模型大鼠结肠组织SP含量及表达的影响，探讨匹维溴胺治疗D-IBS的可能机制。
1 材料和方法
1.1 动物与分组
SPF级雄性Wistar大鼠30只，体重(240±20)g，北京维通利华实验动物公司提供，SCXK(京)2007-0001。随机分为正常、模型和匹维溴胺组，每组10 只。
1.2 药品与试剂
匹维溴胺(法国苏威制药， 610994)，用蒸馏水配制成1 mg/mL混悬液。免疫组化试剂盒(武汉博士德);ELISA试剂盒(美国ADL)。
1.3 仪器设备
RM2235型手动石蜡切片机，EG1150C型包埋机，HI1210摊片机，HI1220型烘片机(德国LEICA)，BX51型反射荧光显微镜(日本OLYMPUS);2010型anthos酶标仪、全自动酶标洗板机(奥地利安图斯)。
1.4 造模方法
按文献方法[1] 进行改良，对模型组和匹维溴胺组进行应激与束缚刺激。18 d循环接受6种刺激：①冷水游泳(14 ℃，5 min);②夹尾(180 s)③禁水(24 h);④禁食(24 h);⑤电击(电压为30 V，电击5 s，间歇5 s，共进行120 s);⑥温箱(40 ℃，5 min)平均每种刺激3次;同时每天用宽透明胶带束缚前肩、前上肢及胸部，限制其搔抓头面部，束缚时间1 h，连续18 d。
1.5 治疗方法
各组造模结束后第2 d开始进行治疗。匹维溴胺组按照实验动物研究“等效剂量”的计算方法，每天15 mg/kg体重灌胃给药;正常组和模型组每天灌服等容量生理盐水，均连续治疗7 d。
1.6 模型评价
包括一般状态观察和体重;排便次数及性状，并于实验第18 天、第25 天记录1 h内粪便点数。病理学观察：各组随机选取2 只大鼠，取其结肠下段， 常规HE染色，光镜下观察结肠组织病理学改变。
1.7 免疫组化方法
采集各组结肠组织块，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片(5 μm)。按SABC免疫组化法进行标记，操作步骤按试剂盒说明进行。DAB室温显色 5～30 min，镜下控制反应时间，阳性染色呈棕黄色。应用免疫组化分析系统进行灰阶度扫描，以平均光密度(OD)表示，每张切片随机取3 个视野进行分析，取其平均值。
1.8 ELISA方法
采集各组结肠组织块用冷盐水洗净，滤纸吸干，按1∶9加入生理盐水制备组织匀浆，离心取上清。按照ELISA试剂盒操作步骤进行，应用全自动酶标仪，在450 nm处测定各孔的OD值，采用CurveExpert 1.3进行标准曲线的绘制，并计算对应的浓度值。
1.9 统计学方法
实验数据用均数±标准差(±s)表示，用SPSS15.0分析，多组间比较用单因素方差分析，P&<0.05为有统计学意义。
2 结 果
2.1 匹维溴胺对D-IBS模型大鼠一般状态影响
与正常组比较，D-IBS模型组大鼠出现易怒好斗、毛色晦暗、食欲下降等表现，其体重随着造模时间的延长逐渐下降;经过匹维溴胺治疗后大鼠一般状态明显改善，其体重开始恢复(表1)。各组大鼠排便情况如表2所示，与正常组比较，D-IBS模型大鼠排便次数明显增多，且粪点不成型，提示大鼠稀便状态持续存在，慢性腹泻形成。匹维溴胺治疗后，排便次数明显减少，便质逐渐恢复正常。说明匹维溴胺对D-IBS模型大鼠腹泻情况具有明显改善作用。表1 匹维溴胺对D-IBS模型大鼠体重(g)的影响表2 匹维溴胺对D-IBS模型大鼠排便粪点数(个)的影响注：*与正常组比较，P&<0.05;**与模型组比较P&<0.05
结肠组织病理学检测结果表明，各组大鼠结肠组织结构完整，未见充血、水肿、溃疡，无症细胞浸润等病理组织学改变。
2.2 匹维溴胺对D-IBS模型大鼠结肠组织SP表达的影响
免疫组化染色观察：SP染色呈棕黄色反应，在结肠黏膜层和肌层均有表达;模型组结肠中免疫反应阳性产物数量多，分布密集，染色较深;匹维溴胺组免疫反应阳性产物减少，染色明显变浅(图1)。如表3所示，模型组SP含量显著升高，与正常组比较差异有统计学意义(P&<0.05)，匹维溴胺组SP含量显著降低，与模型组比较差异有统计学意义(P&<0.05)，说明匹维溴胺能改善D-IBS模型大鼠SP分泌增多的情况。
2.3 匹维溴胺对D-IBS模型大鼠结肠组织SP含量的影响
如表3所示，与正常组比较，模型组大鼠结肠组织中SP含量显著升高(P&<0.05);而匹维溴胺组SP含量显著降低，与模型组比较差异有统计学意义(P&<0.05)，与正常组比较已无显著性差异。说明匹维溴胺能改善D-IBS模型大鼠SP含量增多的情况。表3 匹维溴胺对D-IBS模型大鼠组织SP表达及含量的影响注：*与正常组比较，P&<0.05;**与模型组比较P&<0.05
3 讨 论
IBS病因和发病机制复杂，目前脑肠互动的发病模式和神经内分泌网络的发病机制备受关注，研究较多的是肠神经系统(ENS)和中枢神经系统(CNS)。ENS有“肠脑”之称，既可独立调节胃肠道功能，又可与CNS结合，形成“脑-肠轴”共同来调节胃肠道功能。
脑肠肽是一类同时存在于CNS和ENS的胃肠肽类激素，对胃肠运动和分泌起重要的调节作用。SP是第一个被发现的脑肠肽，为速激肽家族中一个具有 11个氨基酸的多肽，主要分布于肠肌间神经丛和粘膜下神经丛。SP是ENS 中兴奋性神经递质的代表，具有多种生物学活性，如对肠道平滑肌的强烈收缩作用、促进肠蠕动、松弛食管下段括约肌、舒张血管、促进腺体分泌、调节水平衡以及与内脏感觉都有密切关系[2]。SP在IBS发病中的作用目前尚无一致结论。陈晓敏等[3]研究发现IBS结肠粘膜中 SP 含量升高，可能与 IBS患者结肠高动力、粘液分泌增多而致腹泻有关。Lijfrier等[4]研究表明SP参与分泌运动反射，SP可以刺激小肠和结肠分泌水和电解。而王彝康等[5]研究发现 IBS患者血浆 SP 含量明显低于对照组，可能是因为SP参与肠道运动调节形式很复杂，如经典内分泌途径、旁分泌、神经内分泌形式等。本研究结果显示，模型组大鼠结肠组织中 SP 含量明显高于正常组，说明D-IBS模型大鼠结肠组织中存在SP含量升高的病理状态，推测SP升高是导致大鼠腹泻的原因之一，可能与SP刺激肠道水和电解质分泌有关。
胃肠运动受神经、体液和肌原性电活动等方面因素的控制， 脑肠肽对此起重要的调节作用。SP作为肠道兴奋性神经递质，能引起结肠环行肌和纵行肌的收缩。当SP与特异性受体结合后，活化磷脂酶C，催化膜中PIP2水解产生IP3和DG，IP3和DG作为第二信使促进胞内钙库释放Ca2+，使胞内Ca2+升高引起平滑肌收缩。匹维溴胺是选择性作用于胃肠道平滑肌的钙离子通道阻滞剂，可直接作用于肠道平滑肌细胞，通过阻滞电压依赖性钙离子通道，抑制Ca2+内流，降低平滑肌细胞兴奋性，防止平滑肌过度收缩，用以调节肠道运动。本研究结果显示，匹维溴胺明显降低D-IBS模型大鼠结肠组织中SP含量，说明匹维溴胺的药理学机制之一是通过调控SP的分泌与释放水平来实现的，从而减少了SP对Ca2+通道的激活而抑制Ca2+内流。
综上所述，结肠组织中SP分泌与释放异常可能是D-IBS的发生的重要机制之一，而匹维溴胺可以通过抑制SP的异常分泌以改善胃肠道的分泌和运动功能，达到治疗效果。
参考文献
1] Katz R，Roth K，Carroll B.Acute and chronic stress effects on open field activity in the rat:Implications for a model of depression[J].Neurosci Biobehav Rev，1981，5:247.
[2] 夏德雨，王景杰，黄裕新. IBS神经机制研究现状及展望[J].胃肠病和肝病学杂志，2008，17(6): 503-505.
[3] 陈晓敏，张燕华，吴跃龙.肠易激综合征结肠黏膜P物质和血管活性肠肽变化的研究[J].实用临床医学杂志，2008，12(6):31-33.
[4] Lijffler S，Holzer P，Maggi CA，et al. Inhibition of NK1 receptors of the electrically evoked release of acctylcholine from guinca pig myenteric neurons[J]. Naunyn-Schmiedeberg s Arch Pharmacol， 1994， 349(Suppl): R88.
[5] 王彝康，尤汉宁，孙依萍，等. 肠易激综合征患者胃肠激素变化[J].胃肠病学，2001，62 :116-121.