作者：雄英，王娅娜，李宗吉，孙俊峰，棘怀庆， 赵巍
【摘要】 目的 应用生物信息学分析软件预测细粒棘球蚴中国大陆株铁蛋白（Eg. ferritin）氨基酸序列的结构与功能。方法 利用DNAman、NCBI/BLAST公共数据库对目的基因的同源性进行比较分析。应用DNAstar、Biosun 等生物分析软件对铁蛋白的二级结构、抗原表位进行预测分析，应用SWISSMODEL对蛋白的三维结构进行模拟。结果 检索Eg. ferritin氨基酸序列在其功能区的130AA内同源性为97.7%。不同生物间的同源性平均达40.79%。生物软件预测：Eg. ferritin的分子量约16.7 kD，含非极性氨基酸68个，预测其抗原表位肽段为7N-12E，36H -43V， 55S-62H， 69Q-76R， 82A-89E， 102I-107E， 117A -124S，129L-136T。结论 Eg. ferritin的结构和功能及其抗原表位的预测对选取有价值的抗原肽段提供了依据。
【关键词】 细粒棘球蚴中国大陆株；铁蛋白；生物信息学；预测分析
Abstract: Objective To predict the structure and function of Eg.ferritin using bioinformatics method. Methods Homology of ferritin gene was analyzed Using DNAman and NCBI/BLAST database and second structure and antigen peptide of Eg.ferritin and imitate 3D structure of Eg.ferritin was predicted using DNAstar， Biosun et.al. biological softwares to. Results Deduced ferritin amino acid sequence homology was 97.7% in the 130AA and average homology of different species was 40.79% with the published ferritin gene. And it had 68 nonpolar amino acids and had 9 antigen peptide such as 7N-12E， 36H -43V， 55S-62H， 69Q-76R， 82A-89E， 102I-107E， 117A-124S， 129L-136T. Conclusions Using softwares to predict Eg.ferritin structure and antigen peptide can provide some theoretical bases for selecting some valuable antigen peptides.
Key words： echinococcus granulosus；ferritin；bioinformatics；predicting analysis
铁蛋白（ferritin) 是普遍存在于生物体内的一种保守性较高的多功能多亚基蛋白，它不仅调节体内铁的含量，而且在抵抗氧化损害、调节细胞增殖及机体的免疫反应等方面发挥了重要作用［1-4］。据此推断铁蛋白在寄生虫的生理代谢活动中担负着十分重要的作用，因此，它也成为各种寄生虫疫苗研究中备受关注的候选分子。本文通过生物信息学方法预测细粒棘球蚴中国大陆株铁蛋白（Eg. ferritin）氨基酸序列的结构与功能，为进一步研究其生物学功能提供线索，为其在肝包虫的诊断、药物研发和疫苗筛选方面提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
Eg. ferritin基因由本实验室通过RT-PCR成功扩增，其它寄生虫ferritin氨基酸序列源自GenBank。
1.2 方法
通过DNAman、DNAstar对重组基因序列进行分析并推算出其编码的氨基酸序列。通过NCBI、BLAST在线软件将Eg. ferritin cDNA序列与同源性较高的其它动物ferritin基因序列进行同源性分析。通过蛋白质分析软件Biosun和DNAStar将肽链的二级结构（secondary structure）、亲水性参数（hydrophilicity）、抗原性参数（antigenicity）、可塑性参数（flexibility）、表面可能性（Surface Probability）等5种参数综合进行抗原表位的预测。
2 结果
2.1 Eg. ferritin基因开放阅读框基因序列
DNAman 软件对测序后的铁蛋白基因序列进行分析，测序结果表明该基因开放阅读框为435bp，基因序列，见图1。
2.2 Eg. ferritin氨基酸序列的同源性分析
NCBI/Genbank/BLAST进行氨基酸序列的比较分析结果表明，推导的铁蛋白氨基酸序列是由145个氨基酸残基组成，与已知Genbank中ferritin氨基酸序列比较，并且在其功能区内的130AA同源性达97.7%。有三处氨基酸残基 (阴影加黑标记) 与发表序列存在差异，见图2。
用DNAman 对不同生物的铁蛋白氨基酸序列进行同源性分析，其中与牛带绦虫(Taenia saginata)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum)、人铁蛋白H链、曼氏血吸虫(Schistosoma mansion)和肝片虫(Fasciola hepatica)的ferritin平均同源性达40.79%。图3（见封2）中黑色标记区域同源性达100%，粉色为75%，绿色为50%，黄色为33%。
Biosun软件对蛋白二级结构的预测发现二级结构中α螺旋水平较高，而且该Eg. ferritin在真核及原核生物中未发现信号序列酶切位点，也未发现穿膜结构域（图4）。DANstar 对Eg. ferritin的氨基酸序列进行预测，见表1。表1 Eg.ferritin所含氨基酸种类（略）
DNAstar和Biosun软件对Eg. ferritin亲水性参数、可塑性参数以及抗原表位肽段进行预测，两种软件的预测结果基本符合，见表2、3。表2 Eg. ferritin中20种氨基酸可塑性参数（略）表3 Eg.ferriti抗原肽段的预测（略）
3 讨论
随着基因组和功能基因组研究的深入，生物信息学理论和方法也得到了迅猛发展和广泛应用。利用生物信息学方法对蛋白的二级及三级结构进行分析和模拟是一种快捷有效的方法［5-6］。本实验室于2006年成功克隆出细粒棘球蚴中国大陆株Eg. ferritin［7］并注册到GenBank。经DNAman软件对本室扩增的Eg. ferritin基因序列进行分析，发现该序列与互联网上检索序列(肯尼亚株)有所不同：检索的基因序列为522bp，而我们得到的基因序列长度为562bp，并推导出其包含145AA。在NCBI/BLAST公共数据库中氨基酸序列在130AA内同源性达97.7%。Thompson研究认为细粒棘球绦虫在长期的演化过程中会引起遗传基因的改变［8］，据此我们考虑该基因可能是我国细粒棘球蚴虫株特有的，有望作为预防当地包虫病疫苗的候选基因，可能在虫株的鉴别诊断上也有一定的应用价值。
利用DNAman等生物学软件推导铁蛋白的氨基酸序列，预测其蛋白质二级结构和抗原表位，以及模拟其三级结构。经软件分析的结果来看，铁蛋白是生物体中的一个保守性很高的蛋白，并在长期进化过程中被保留下来，其具有的相同氨基酸序列，可能是影响整个铁蛋白功能的核心区即功能域；DNAstar，Biosun对其二级结构进行了预测，结构显示在Eg.ferritin中α螺旋水平较高，说明该蛋白的柔韧性和弹性较好，具有较好的稳定性，在真核及原核生物中未发现信号序列的酶切位点和跨膜结构域，并且两软件对铁蛋白抗原肽段的预测结果基本一致，提高了预测的可靠性。这些区域和结构的确认为铁蛋白功能的进一步探索提供了一定的参考资料，并且为后续选取Eg. ferritin中有抗原价值的肽段，制备多肽段联合疫苗提供了一种可借鉴的手段。
参考文献
［1］Wang QL， Kong B， Huang HQ， et al. Progress in Structural and Functional Study of Nanometer Protein Shell of the ferritin［J］. Progress in Chemistry， 2004， 16(4):516-519.
［2］Andrews SC．Iron storage in bacteria［J］．Adv Microb Physiol，1998， 40：281.
［3］Ponka P．Recent advance in cellular iron metabolism［J］．The Journal of trace elements in experimental medicine， 2003，10:201-207.
［4］Theil EC. ferritin:at the crossroads of iron and oxygen metabolism ［J］. J Nutr， 2003， 5（Suppl1）：49-53.
［5］王键，师志云，赵巍，等.宁夏人细粒棘球蚴重组延伸因之－1重组蛋白特性分析及抗原表位预测［J］.中国药学杂志，2008，43（9）：654-657.
［6］棘怀庆，雄英，赵巍，等.细粒棘球蚴中国大陆株谷胱甘肽S-转移酶结构与功能的生物信息学分析［J］. 宁夏医科大学学报，2009，31（2）：150-153.
［7］王娅娜，赵嘉庆，赵巍，等. 细粒棘球蚴中国大陆株铁蛋白基因分子克隆和序列分析［J］.宁夏医学院学报，2006，27（4）：253-255.
［8］Thompson RCA， Lymbery AJ. Echincoccus and Hydatid Disease ［M］. Oxon: CAB International， 1995：50.