【摘要】 目的 研究麝鼠香(Muskrat musk，Mrm)对大鼠心肌缺血(myocardial ischemia， MI)模型心肌细胞凋亡及Bcl-2/Bax蛋白表达的影响。方法 通过结扎大鼠左冠状动脉前降支复制大鼠MI模型。实验动物随机分为6组：假手术组、模型组、阳性对照组、麝鼠香高、中、低(600、300、150mg·kg-1·d-1剂量组)。采用原位末端标记(TUNEL)法进行细胞凋亡指数检测;免疫组化法检测Bcl-2、Bax蛋白表达。结果 与模型组比较，麝鼠香高、中剂量组心肌细胞凋亡指数明显降低，Bcl-2蛋白表达水平显著升高，Bax蛋白表达明显降低，Bcl-2/Bax比值升高，差异均有统计学意义(P&<0.05或P&<0.01)。结论 麝鼠香通过调控Bcl-2/Bax蛋白表达，能有效抑制心肌细胞凋亡的发生，对缺血心肌提供保护作用。
【关键词】 麝鼠香;心肌缺血;细胞凋亡;Bcl-2;Bax
麝鼠香(Muskrat musk，Mrm)为成年雄性麝鼠(Ondadra zibethica L.)香囊内乳白色分泌物。麝鼠在我国资源分布广，数量较多，且早在《回回药方》中就有记载，称之为“木阿里”[1]，并在回族民间广为流传。麝鼠香不仅具有与天然麝香相似的香气，而且还含有很多相同的化学成分，如麝香酮(muscone)、降麝香酮(cyclopentadecanone)、大环酮类、肽和氨基酸类等[2]，具有抗炎、镇痛等与天然麝香极为相似的药理作用[3]。麝鼠香在降低心肌耗氧量及改善血液流变学方面，对犬及大鼠缺血心肌起到保护作用[4]。本研究拟探讨麝鼠香对大鼠急性心肌缺血损伤后期心肌细胞凋亡及Bcl-2/Bax蛋白表达的影响。
1 材料与方法
1.1 动物
健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重250～280g，由宁夏医科大学实验动物中心提供。
1.2 主要仪器及药品
LDZ5-2医用离心机(北京医用离心机厂生产);Olympus BH-2型显微镜(Olympus Corp， Japan);BL-2000医学图像分析系统(成都泰盟科技有限公司生产)。
麝鼠香(吉林省康乃尔药业提供，批号：090510);复方丹参滴丸(天津天士力集团生产，批号：090112);细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物工程科技发展有限公司提供，批号：090606);Bcl-2一抗、Bax一抗、即用型SABC试剂盒及DAB显色剂(武汉博士德生物工程有限公司提供)。
1.3 方法
1.3.1 建立模型 采用结扎左冠状动脉前降支法建立大鼠急性心肌缺血模型[5]。先将所有大鼠测试心电图(标准Ⅱ导联)，心电图异常者剔除。选取合格大鼠，乙醚麻醉，胸部备皮，常规消毒后，在切口周围做荷包缝合准备(以备关闭胸腔)，沿锁骨正中线行切开皮肤术，在第四或第五肋间钝性分离胸部肌肉，打开胸腔，剪开心包，挤出心脏。在动脉圆锥与左心耳之间以无创性缝合线结扎冠状动脉，速将心脏置回胸腔内，并迅速拉紧荷包缝合线，关闭胸腔，开胸时间不超过60s。以结扎处周围心肌变白、搏动减弱且心电图出现ST段弓背向上抬高者为造模成功大鼠。术后给予青霉素20万U·kg-1，肌肉注射，防止感染。
1.3.2 分组及给药 实验共分为6组：假手术组、模型组、阳性对照组、麝鼠香高、中、低剂量组，见表2。
采用随机数字表法，选取10只大鼠作为假手术组(仅将无创性缝合线穿过左冠状动脉而不结扎，其余操作均同造模方法)。术后24h，再选取造模成功大鼠50只，随机分为5组，即模型组、阳性对照组、麝鼠香高、中、低剂量组，每组10只，各组大鼠灌胃给药。麝鼠香高、中、低剂量组生药浓度分别为600、300、150mg·kg-1·d-1，阳性对照组给予复方丹参滴丸450mg·kg-1·d-1，假手术组、模型组给予等体积的生理盐水，连续给药21d。
1.3.3 制备检测标本 给药期结束，摘取大鼠心脏，置于冰盐水中洗涤数次，除去血污，取结扎周围心肌缺血区约8mm×8mm×2mm心肌标本2块。标记后置于4%甲醛溶液中固定12h，常规石蜡包埋，以备细胞凋亡及Bcl-2、Bax检测。
1.3.4 心肌细胞凋亡情况及Bcl-2、Bax的测定
采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况。将石蜡包埋的心肌标本做5μm厚度切片，根据TUNEL试剂盒说明书进行标记染色，在显微镜(×400)下观察每个视野中的凋亡细胞数及细胞总数，每组共数10个视野。然后取其均值作为该组的代表值。计算公式为：凋亡指数(%)=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%。判断标准：凋亡的心肌细胞核内分布有棕褐色颗粒，体积等于或小于正常细胞核。
采用链霉素亲合素-生物素-酶复合物(Strept Avidin-Biotin-enzyme Complex，SABC)法，进行Bcl-2和Bax蛋白免疫组织化学检测。石蜡切片经微波修复抗原，二氨基联苯胺(DAB)染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片后，利用图像分析系统，进行显微摄像。以心肌细胞胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性判断标准，在显微镜(×200)下随机选取10个视野，利用BL-2000医学图像分析系统，测定其平均光密度(OD值)及阳性细胞百分比，计算Bcl-2和Bax蛋白阳性表达指数(positive expression index，PEI)，PEI=OD值×阳性细胞百分比×100，并计算Bcl-2与Bax的比值。
1.4 统计学方法
所有数据用均数±标准差(±s)表示，采用SPSS 15.0统计软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，P&<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 心肌细胞凋亡情况及凋亡指数
显微镜(×400)下观察大鼠心肌细胞核：假手术组多呈蓝色，说明凋亡数极少(图1①，见插页2);模型组多呈棕褐色、皱缩不规则，说明凋亡数较多(图1②，见插页2)，且细胞凋亡指数明显高于假手术组，差异有统计学意义(P&<0.01)。
与模型组比较，阳性对照组、麝鼠香高、中剂量组的凋亡指数均减少(P&<0.01)。说明三组均可减少心肌细胞凋亡的发生，对大鼠心肌细胞具有保护作用。
与阳性对照组比较，麝鼠香中剂量组凋亡的心肌细胞明显减少(图1③、④，见插页2)，凋亡指数减少(P&<0.05)。说明麝鼠香中剂量组对大鼠心肌细胞的保护作用优于阳性对照组，在进行干预治疗的4组中效果最佳，见表1。表1 各组心肌细胞凋亡指数(AI)比较与假手术组比较**P&<0.01;与模型组比较△△P&<0.01;与阳性对照组比较▲P&<0.05
2.2 心肌细胞Bcl-2和Bax蛋白含量
显微镜(×200)下观察大鼠心肌细胞胞浆内棕黄色颗粒：Bcl-2检测显示，模型组较假手术组心肌细胞胞浆内棕黄色颗粒的数量减少(图2①、②，见插页2);Bax检测显示，模型组较假手术组心肌细胞胞浆内棕黄色颗粒的数量增多(图3①、②，见插页2)，差异均有统计学意义(P&<0.05);Bcl-2/Bax降低，差异具有统计学意义(P&<0.05)。
与模型组比较，阳性对照组、麝鼠香高、中剂量组Bcl-2增加(P&<0.05)，图2③(见插页2);麝鼠香中剂量组Bax减少(P&<0.05)，图3③(见插页2);上三组Bcl-2/Cax比值均升高明显(P&<0.05)。说明三组药物可有效调节Bcl-2和Bax蛋白表达水平，详见表2。1期袁玲，等.麝鼠香调控Bcl-2/Bax蛋白表达抑制缺血性大鼠心肌细胞凋亡表2 各组心肌细胞Bcl-2和Bax含量比较
3 讨论
心肌缺血是由于冠状动脉血流和心肌需求之间不平衡而导致的。根据心肌缺血发生的快慢、缺血程度的轻重、缺血时间的久暂和缺血后血流的恢复情况等因素，缺血心肌在形态、功能和代谢等诸多方面可呈现不同形式的损伤。在血流没有恢复之前，如何保存、延长缺血的心肌细胞活力，阻止可逆性损伤向不可逆性损伤演变，是防治心肌缺血的关键[6]。有研究证实，MI梗死区同时存在细胞凋亡和坏死，故设法阻断凋亡信号转导途径，减少细胞凋亡及迟发性细胞坏死可能是减少缺血区细胞死亡的一条有效途径[7]。
在与细胞凋亡有关的基因中，原癌基因Bcl-2是目前公认的促进细胞生存、抑制细胞凋亡的长寿基因[8]，而Bax基因高表达可抵消或减轻Bcl-2基因的抑制凋亡效应并促进凋亡的发生，故Bax基因被称为凋亡促进基因[9]。因此诱导心肌细胞Bcl-2基因表达，抑制Bax基因表达，成为探索心肌保护措施的新途径[10]。正常情况下，Bcl-2基因在心肌中不表达，Bax基因仅有弱表达。心肌缺血后，Bcl-2基因和Bax基因在心肌细胞中均有表达，Bcl-2基因的过度表达能明显抑制心肌缺血后心肌细胞凋亡，减少梗死面积。Bcl-2基因与Bax基因在凋亡调控中存在着密切的相互作用，Bcl-2/Bax的比值决定了细胞的命运[11]。
本实验通过TUNEL法最为简捷、可靠的检测细胞凋亡，结果显示，假手术组心肌细胞凋亡数量极少，而模型组缺血边缘区有大量心肌细胞凋亡;与模型组相比，麝鼠香各给药组凋亡系数均下降，其中中剂量组凋亡系数降低最为明显，提示一定剂量的麝鼠香在急性心肌缺血损伤后期，对损伤心肌有较明显的抗凋亡作用。
本实验显示，在急性心肌缺血后期，模型组Bcl-2蛋白表达较假手术组降低，Bax蛋白表达较假手术组升高;而麝鼠香中剂量组Bcl-2蛋白表达较模型组明显升高，Bax蛋白表达较模型组降低，且Bcl-2/Bax比值升高明显。推测由于模型组在缺血后期纤维增生，使梗死边缘的心肌处于缺血缺氧状态，从而诱导心肌细胞凋亡，使Bax蛋白过度表达。在心肌细胞缺血损伤后，一定剂量的麝鼠香能够促使Bcl-2蛋白立即启动，其基因产物的表达可抑制或逆转细胞凋亡的发生，Bcl-2蛋白的表达有效地抑制了Bax蛋白的表达，从而保护了心肌缺血后期存活的细胞。
参考文献
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