作者：姜怡邓 马琳娜 ，韩学波 王菊，徐支芳 于海娇
【摘要】 目的探讨基因组DNA甲基化变化在Hcy致VSMCs增殖的作用机制。方法原代培养VSMCs并鉴定，用0、50、100、200、500μM浓度Hcy干预，MTT法检测VSMCs活性;SssI甲基转移酶法分析基因组DNA甲基接受能力，甲基化敏感性限制性内切酶法分析基因组DNA甲基接受能力及DNA甲基转移酶活性。结果 MTT法表明在50μM Hcy时，VSMCs活性明显增加，其余活性下降，与各浓度组并不呈量效依赖关系;Hcy可增加DNA甲基接受能力，以50μM Hcy组效应最显著(P&<0.05);HpalI限制核酸内切酶消化，与对照组比较，基因组DNA甲基化接受能力减少了50.1%、41.7%、46.1% 和 25.5% (50、100、200、500μM Hcy组)，BssHII限制核酸内切酶消化后，基因组DNA甲基化接受能力减少了约25.5%、18.1%、17.4%和18.0% (50、100、200、500μM Hcy组)。结论 Hcy引起VSMCs基因组DNA去甲基化是平滑肌细胞增殖的重要机制之一，其效应偏重发生于CpG二核苷酸序列，CpG岛所受影响相对较小，其最大效应在50μM Hcy组，且无明显的量-效依赖关系。
【关键词】 同型半胱氨酸; 平滑肌细胞增殖; 基因组DNA甲基化
动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)所致的心脑血管疾病是当今严重危害人类生命健康的疾病之一，其发病率和死亡率居各类疾病之首。循证医学证据表明[1-2]，同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)是AS形成的独立危险因子之一[3]。在AS的发生发展过程中，血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的活化、增殖以及浸润功能的改变是AS形成的中心环节[4]，国内外学者已对其展开了广泛的研究，但Hcy引起VSMCs增殖及其导致AS的发病机制尚未完全阐明。本文拟采用不同浓度Hcy干预原代培养的VSMCs，通过检测VSMCs基因组DNA甲基化的变化，旨在阐明基因组DNA甲基化在Hcy致VSMCs增殖中的作用机制，为预防和治疗AS提供一全新的视角。
1材料和方法
1.1药品和试剂
DEME/F12干粉状培养基购自Gibco公司;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所产品;胰酶、Hcy、L-多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)、谷氨酰胺购自Sigma公司;poly[dI-dC]. poly[dI-dC]、[methyl-3H]SAM、HpaIl、BssHIl、SssI methylase(CpG methylase)均购自Sigma公司;鼠抗人平滑肌肌动蛋白单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司;即用型SABC免疫组化染色试剂盒、基因组DNA提取试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;新鲜脐带取自银川市妇幼保健院。
1.2实验方法
1.2.1原代平滑肌细胞的培养和鉴定剖宫产术后的胎儿脐静脉，用D-HanK's液(含100U·mL-1青霉素、100μg·mL-1链霉素)，反复冲洗干净脐静脉，纵向剪开，棉签轻轻拭去内膜，将血管条剪成1mm×1mm的血管小块，用弯头吸管将血管小块移入培养瓶内，以3~5块/cm2密度均匀贴于培养甁底，培养甁内加入1~1.5mL DMEM/F12培养液，置37℃、5%CO2孵箱培养，每3天换液1次，待细胞融合成片时，即可传代。人脐静脉VSMCs经相差显微镜及α-actin免疫组织化学鉴定，取第3~5代用于实验研究。
1.2.2实验分组
实验共分为5组， 分别含0、50、100、200、500μmol·L-1 Hcy的完全培养基孵育细胞，每组6孔细胞。
1.2.3MTT法检测VSMCs的增殖活性
用0.25%胰蛋白酶消化单层平滑肌细胞，用含10%胎牛血清的培养液DEME/F12配成单个细胞悬液，以每孔103~104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200μL。培养3~5d后，每孔加入MTT溶液(5mg·mL-1)20μL，37℃继续孵育4h，终止培养，离心(1000rpm，5min)，然后弃去孔内培养液，每孔加入150μL DMSO，振荡10min，充分溶解。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。
1.2.4SssI甲基转移酶法分析基因组DNA甲基接受能力按照试剂盒操作抽提DNA， DNA的甲基接受能力可间接反应基因组甲基化的水平，甲基接受能力高表明基因组原有的甲基化水平低，反之则甲基化水平高。利用细菌SssI甲基转移酶催化DNA的CpG位点发生甲基化，3H 标记的S-腺苷甲硫氨酸(3H-SAM)为甲基供体，测到的放射性强度即为DNA甲基接受能力，与基因组原有的甲基化水平成反比。甲基化接受能力反应体系:SssI methylase:3units;3H-SAM:2mCi3.0mM;纯化的DNA:0.5μg;缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM NaCl、10mM MgCl2、pH 7.9)X;终体积:20μL。在30℃孵育1h，将上述液体点在WhatmanGF/C滤纸上，用冷50g·L-1三氯醋酸洗3次，液闪活性计每分数值为cpm/μg DNA。
1.2.5DNA甲基转移酶(DNMT)活性测定
将2×106平滑肌细胞中加入500μL细胞裂解缓冲液，37℃水浴-80℃冰箱中反复冻融3次，混匀，采用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。每一样本作双管测定，每次测定均设VSMCs阳性对照及不加Poly[d(I-C)d(I-C)]的阴性对照。取5μg细胞裂解蛋白与0.5μg poly[d(I-C) d(I-C)]及3μCi 3H-SAM 置于1.5 mL eppendorf 管中(总体积20μL)，混匀，37℃水浴120min。加入300mL反应终止液[0.35mmol·L-1SDS、2mmol·L-1 EDTA、125mmol·L-1NaCl、1.9mmol·L-1对氨基水杨酸钠、1%(体积分数)丁醇、0.25g·L-1 鲑精DNA，1g·L-1蛋白酶K]，37℃水浴30 min。酚(pH 8.0) 抽提乙醇沉淀poly[d( I-C)d( I-C)]，加入40μL 0.3mmol·L-1 NaOH 37℃水浴60 min。将上述液体点在WhatmanGF/C滤纸上，80℃烘干5min，用冷50g·L-1三氯醋酸洗3 次，冷无水乙醇洗2次，80℃烘干5min。置于5mL二甲苯闪烁液中测定液闪活性，计每分cpm值。以样本每分计数值比阳性对照每分计数值表示C-5 MTase相对活性。
1.2.6甲基化敏感性限制性内切酶法分析基因组DNA甲基接受能力将提取细胞DNA，加入限制性酶切反应体系:[HpaII:(20U·μL-1)0.25μL;BssHII:(10U·μL-1)0.5μL;纯化的DNA:5μg]，混匀，4℃放置24h，然后用E.Z.N.A纯化试剂盒纯化，其余步骤同上。
1.3统计学方法
结果以(±s)表示。两样本均数间比较采用Student’s t检验，多样本均数间比较采用One-way ANOVA检验，组间的两两比较采用Student-Newman-Keuls检验，P&<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1相差显微镜和免疫组化鉴定培养的VSMCs
细胞培养第5天时，用相差显微镜观察可见少量细胞从组织块周围游出，细胞呈梭形或长梭形排列，此后细胞呈放射性生长，至培养2周左右局部形成的细胞呈平行排列，部分区域细胞多层重叠，高低起伏呈“峰、谷状生长(图1见封2)。α-肌动蛋白免疫组化染色:98%的细胞染色呈阳性:胞浆内呈现棕黄色，胞核不着色，表明细胞含有肌动蛋白，证实为VSMCs (图2见封2)。
2.2Hcy对VSMCs 增殖和DNMT活性的影响
VSMCs与不同浓度Hcy作用72 h后，在50μM Hcy组，VSMCs数量明显增加，而100、200、500μM Hcy组VSMCs数量反较对照组减少。这说明一定浓度的Hcy(50μM左右)促进VSMCs增殖，而Hcy高浓度时，则可造成VSMCs损伤，VSMCs数量反减少;Hcy使DNA甲基转移酶(DNMT)活性增加，它的最大值亦在50μM Hcy浓度组，与对照组比较， 差异有统计学意义(P&<0.05);在其他浓度组，DNA甲基转移酶活性也明显增加，结果见表1。表1不同浓度Hcy对VSMCs和DNMT活性的影响
2.3敏感性限制性核酸内切酶分析VSMCs内DNA甲基接受能力
DNA的甲基接受能力可间接反映基因组甲基化的水平，甲基接受能力高表明基因组原有的甲基化水平低，反之亦反。结果(表2)表明：Hcy可促使DNA去甲基化，但各浓度组并不呈量效依赖关系，以50μM Hcy组的去甲基化效应最显著。
甲基敏感限制性核酸内切酶法分析DNA甲基接受能力可以观察Hcy对基因组DNA甲基化改变和位点的影响。DNA甲基限制核酸内切酶，可以识别非甲基化的胞(核)嘧啶序列(CG)，并有特异性的酶切作用，但对甲基化的mCG 没有作用。如:HpaII，对 C↓CGG序列有特异性作用;BssHII 对CpG 岛(GC↓GCGC) 有特异性作用，因此采用HpalI和BssHII限制核酸内切酶法可以分析和判断基因序列中甲基化位点和基因组DNA甲基化的改变。
Hcy处理后，HpalI限制核酸内切酶消化，与对照组比较，基因组DNA甲基化接受能力减少了50.1%、41.7%、46.1% 和25.5% (50、100、200、500μM Hcy组);BssHII限制核酸内切酶消化后，与对照组比较，基因组DNA甲基化接受能力减少了约25.5%、18.1%、17.4%和18.0% (50、100、200、500μM Hcy组)。这意味着Hcy引起基因组DNA低甲基化更倾向于HpaII切点，即Hcy引起基因组去甲基化主要在 C↓CGG 序列而不是 GC↓GCGC。由于Hcy引起了基因组低甲基化，暴露出了更多的DNA甲基化接受位点，经限制核酸内切酶消化相应的CG位点后，基因组DNA甲基化接受能力下降，在对照组酶切消化后，基因组DNA甲基化接受能力下降，且以BssHII酶切引起的下降更明显，提示CpG岛原有的甲基化程度低于一般CG序列，所以会有更多的GC↓GCGC被切割。同时本结果也再次显示引起基因组DNA去甲基化的Hcy最佳浓度位于50μM左右。表2不同浓度Hcy对DNA甲基化接受能力的影响
3讨论
Hcy已被公认为是致AS的主要独立危险因子之一[1]，已报道的Hcy致AS的主要机制包括促进氧化应激、细胞凋亡、炎症反应以及导致NO系统的功能紊乱等等[1-2]。近年来，表观遗传学(Epigenetic)调控是目前研究的热点，DNA甲基化是主要方式之一，Hcy由于参与转甲基反应的甲硫氨酸循环[1]，对DNA甲基化有一定的影响，但有关机制的研究尚未明确。
本文结果清楚显示，Hcy浓度升高引起基因组广泛去甲基化，去甲基化位点偏向于一般的CpG二核苷酸序列，而CpG岛所受影响较小，这与癌细胞基因组广泛的去甲基化，和某些特定基因(主要是抑癌基因)启动子区的高甲基化极其相似。至于何以出现去甲基化位点偏向于一般的CpG二核苷酸序列，而CpG岛所受影响较小，我们推测，正常时细胞基因组中70%的CpG二核苷酸序列是甲基化的，它们主要见于内含子、重复序列、潜在的活性转移成份等，甲基化保持了他们的静默;而某些基因启动子区的CpG岛，特别是管家基因启动子区的CpG岛通常并不甲基化。因此，当Hcy引起基因组广泛去甲基化时，则显示出去甲基化位点偏向于原本已甲基化的CpG二核苷酸序列。同时Hcy引起VSMCs内源性DNA甲基转移酶活性的增加与DNA去甲基化程度的增加显示出非常平行的时间动力学上的一致性，提示该酶活性的增加可能是对抗DNA去甲基化的一种代偿反应。由于活性升高的DNMT使一些原本并未甲基化的某些基因，如P53、ER-α等[1-2]启动子区的CpG岛出现了高甲基化，从而出现了去甲基化和高甲基化并存的局面，这从又一角度证实了我们的推测。
本研究结果同时显示，Hcy引起基因组去甲基化并不呈剂量依赖关系，引起DNA甲基化程度变化最明显的是50 μM Hcy组。这一结果在我们研究的“Hcy对VSMCs内DNA甲基接受能力和内源性DNA甲基转移酶活性影响的分析;DNA 甲基敏感性限制性酶切分析”多次相关的重复实验中，皆显示出50 μM Hcy对甲基化的影响最显著，提示这一效应并非实验偶然因素所致，但何以无量-效关系，我们尚无确切的解释，一个推测是高Hcy可通过多种机制致病，Hcy浓度在50μM左右时，显示出较明显的对DNA甲基化修饰的干扰，浓度进一步升高后，其促进氧化应激、细胞凋亡、炎症反应等机制可能对细胞造成更严重的伤害，从而掩盖其对DNA甲基化修饰的影响。
本实验让我们对基因组DNA甲基化在同型半胱氨酸致平滑肌细胞增殖中的作用机制有了深入的认识，这也为进一步探索预防和治疗AS性心脑血管疾病提供了一个新的理论依据。
参考文献
[1]Boushey CJ， Beresford SAA， Omenn GS， et al. A quantitative assessment of plasma homocysteine as a risk factor for vascμlar disease: probable benefits of increasing folic acid intakes[J].JAMA，1995，274:1049-1057.
[2]Eikelboom JW， Lonn E， Genest JJ， et al. Homocysteine and cardiovascμlar disease: a critical review of the epidemiologic evidence[J]. Ann Intern Med， 1999，131: 363-375.
[3]Jiang YD，Zhang JZ，Huang Y，et al.Homocysteine-mediated expression of SAHH，DNMTs，MBD2，and DNAhypomethylation potential pathogenic mechanismin VSMCs[J].DNA Cell Biol，2007，26(8):603-611.
[4]Turhan H，Erbay AR，Yasar AS，et al.Plasma homocysteine levels in patients with isolated coronary artery ectasia[J].Cardiol，2005，104(2):158-162.
[5]Lund G， Andersson L， Lauria M，et al. DNA methylation polymorphisms precede any histological sign of atherosclerosis in mice lacking apolipoprotein E[J]. J Biol Chem， 2004 ，279(28):29147-2954.
[6]Esteler M.CpG island methylation and histone modifications:biology and clinical significance[J].Ernst Schering Res Found Workshop，2006，(57):115-126.
[7]Hiltunen MO， Turunen MP， Hkkinen TP， et al. DNA hypomethylation and methyltransferase expression in atherosclerotic lesions[J].Vasc Med，2002，7(1):5-11.
[8]Lawrence de Koning AB， Werstuck GH， Zhou J， et al.Hyperhomocysteinemia and its role in the development of atherosclerosis[J].Clin Biochem，2003，36(6):431-441.
[9]Yan SK， Chang T， Wang H， et al.Effects of hydrogen sμlfide on homocysteine- induced oxidative stress in vascμlar smooth muscle cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2006 ，351(2):485-491.
[10]董剩勇， 舒茂琴.高同型半胱氨酸血症与心血管疾病的研究进展[J].临床心血管病杂志，2005， 21 (2) : 123-125.
[11]Pogribuy I，Yi P，James SJ. A sensitive new method for rapid detection of abnormal methylation patterns in global DNA and within CpG islands[J].Biochem Biophys Res Commun， 1999，262(3):624-628.