【关键词】 血清 一氧化氮测定
一氧化氮(Nitric Oxide，NO)是一种化学性质比较活泼的气体分子。在生理条件下，机体内NO浓度极低，但它们在机体内却发挥着重要又独特的生理作用;在病理条件下，当NO的代谢失衡时，就会导致心血管、呼吸、神经等系统的多种疾病。因此，血清NO浓度已经成为衡量人体健康与疾病状态的重要指标之一，也成为监测很多疾病状态的重要指标。为此，必须建立精确、简便、快速、灵敏的检测方法来监控血清NO含量。本文将对血清NO测定方法进行综述。
1 NO的合成及代谢
NO是一种亲脂性的小分子化合物，分子量为30，难溶于水，因此NO在细胞内产生后，可以透过生物膜自由扩散进入周围的靶细胞，进而执行信号分子的功能。在生物体内左旋精氨酸(L-Arg)在NO合酶(NOS)作用下与O2结合生成左旋胍氨酸(L-Cit)及NO。生物体内许多细胞是通过此途径来合成NO的，如中枢神经元、内皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、血小板、肝细胞及肿瘤细胞等。催化此反应的NOS有三种同功酶：主要存在于内皮细胞中的eNOS (endothelial nitric oxide synthase)，存在于神经细胞中的nNOS (neuronal nitric oxide synthase)，以及存在于巨噬细胞、胶质细胞中的iNOS (inducible nitric oxide synthase)。eNOS和nNOS均为构成型酶，统称为cNOS (constitutive nitric oxide synthase)。前2种催化生成的NO量较少，仅在10-12 mol/L水平，主要调节细胞的信息传递;iNOS催化生成的NO约在10-6 mol/L水平，具有细胞毒素或细胞防护功能[1]。此外，临床上应用的硝基扩血管物质(如硝酸甘油)进入机体后，也可以通过一系列生化反应释放NO，是局部产生NO的化合物[2]。生成的NO在生物体液中的半衰期很短，很快就转变为硝酸盐/亚硝酸盐的代谢产物。
2 血清NO的测定方法
根据NO在生物体内的合成及代谢特点，文献常以其代谢产物间接反应NO的浓度。目前文献报道的测定血清NO应用的方法有：硝酸盐还原酶法、镀铜镉振荡还原法、改良的Griess法、催化光度法、示波极谱法、分光光度法、化学发光法。下面就每种测定方法做一介绍。
2.1 硝酸盐还原酶法 董燕等[3]利用NO在体内被氧化成NO-2和NO-3，可用硝酸盐还原酶(NR)将NO-3还原成NO-2，再用Griess试剂与NO-2反应生成有色偶氮产物的原理来测定NO。在反应中，用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(GD)使NADP+还原生成NADPH，这样，NADPH被循环使用，反应体系中的NADPH就保持在较低浓度，从而避免了高浓度的NADPH对NO-2重氮反应的干扰。
利用测定液生成的有色偶氮产物在540～560 nm处最大吸收，测定其吸光度值。该方法的线性回归方程为：Y=120.8X-2.2，r=0.997 5;平均回收率为93.8 %;测得健康人血清NO的正常参考值范围为：5.7～48.7 μmol/L。
2.2 镀铜镉振荡还原法 郑晖等[4]用Zn(OH)2将血清中的蛋白沉淀，利用镀铜镉颗粒将去蛋白血清中的NO-3还原成NO-2，再用Griess试剂与NO-2反应生成有色偶氮产物的原理来测定NO(NO-2/NO-3)。该法测定NO(NO-2/NO-3)的线性回归方程为：Y=0.012 2+0.012 2X，r=0.999，P&<0.01;平均回收率为94.2 %;按两倍试剂吸光度对应NO-2浓度计算，检测下限为1.1 mol/L;测得健康人血清NO(NO-2/NO-3)的正常参考值范围为：38±14.2 μmol/L。
2.3 改良的Griess法 李恩民等[5]通过锌粉还原反应使血清中的NO-3还原成NO-2，正丁醇萃取去除血清中的干扰物质，然后进行Griess显色反应，最终把显色物萃取到正丁醇相中进行比色测定。该法测定NO的线性回归方程为：Y= -8.10×10-4+6.14×10-4X，r=0.999 5，P&<0.001;检测下限浓度为3.04 mol/L，平均回收率为98.5 %;测得健康人血清NO(NO-2/NO-3)的正常参考值范围为：30.60±16.16 μmol/L。
2.4 催化光度法 李桂兰等[6]先用镀铜镉颗粒将血清中NO-3还原成NO-2，再根据NO-2对溴酸钾氧化还原型罗丹明B生色有强烈催化作用，进行NO-2的催化光度法测定。这一类催化体系检出限最低可达10-12 g/mL[7]。该方法的平均回收率为104.1 %，测得的健康人血清NO(NO-2/NO-3)的参考值范围为：54.2±16.9 μmol/L。
2.5 示波极谱法 孙成均等[8]选择示波极谱法利用二阶导数极谱仪在盐酸-磺胺-盐酸萘乙二胺-氨水体系中测定血清中的NO-2，以测定NO-2量间接推算NO的量。此方法原理为：血清中的NO-2在稀盐酸介质中与磺胺和盐酸萘乙二胺反应生成偶氮化合物，在氨碱性介质中生成的偶氮化合物可产生灵敏的极谱波，波高与NO-2含量在一定范围内成正比关系，并利用峰高计算血清中的NO-2，该方法血清中的NO-2的计算式为：血清中NO-2含量(μmol/L)=hx/b×1/(0.10×46)[式中hx为样品峰高，b为工作曲线斜率，0.10为取样品量(mL)，46为NO-2摩尔质量];本法检出限为0.56 g/L，相应血清浓度为0.61 mol/L，该方法平均加标回收率为100.6 %;测得健康人血清NO(NO-2)的正常参考值范围为：0.85±0.22 μmol/L。
2.6 分光光度法 李恩民等[9]利用自制的氢氧化铝[Al(OH)3]凝胶清除血清中的有色成分，得到无色透明的血清脱色液。利用醋酸钠、对氨基苯磺酸及α-萘胺溶液使标准管中NO-2标准使用液和样品管中血清脱色液分别显色，利用分光光度法检测血清脱色液中的NO-2。本方法的检测下限是0.043 μmol/ mL，回收率是93.5 %，正常人血清NO含量是0.323±0.022 μmol/ mL。
2.7 化学发光法 邓学良等[10]建立了Luminol-I--NO-2化学发光系统间接测定血清中NO-2，此方法的回归方程为Y=7.62X-0.22，r=0.991 2，测定NO-2的线性范围为(0.018～300) μg/L，检出限为0.026 μg/L。这种方法与文献[11]中介绍的化学发光法(鲁米诺法)不同。鲁米诺法的原理是NO可被h3O2强烈的氧化生成ONOO-，而ONOO-可使鲁米诺氧化并在溶液中发出很强的光。因为只有NO可以激发这一光化学反应，而NO-2和NO-3则不能，所以该方法是可对溶液中的NO进行实时测定且检测灵敏度最高的方法，其检出限可达10-13 mol/L，是直接测定NO的方法。
3 小结
由于NO在生物体内半衰期极短(大约几秒钟)，很快就被转变为硝酸盐/亚硝酸盐(NO-2/NO-3)的代谢产物，所以临床上不能直接测定血清NO含量，而是通过测定血清中其代谢产物含量间接代表血清NO含量。而通常应用的方法是将血清经过除蛋白、脱色处理，处理后血清中的NO-3再通过各种还原性物质(如：硝酸盐还原酶、镀铜镉颗粒、锌粉)还原成NO-2，然后通过Griess试剂显色及分光光度法来测定血清NO(NO-2/NO-3)，或者通过催化光度法测定，均是通过测定血清中原有的NO-2和由NO-3还原成的NO-2的总量来间接表示血清中NO含量。示波极谱法测定血清中的NO是直接利用血清中的NO-2在盐酸-磺胺-盐酸萘乙二胺-氨水体系中生成的有色偶氮化合物在氨性底液中有灵敏极谱波峰，波高与NO-2含量在一定范围内成正比关系，并利用峰高计算血清中的NO-2，不需将血清中的NO-3还原为NO-2，血清也不需做除蛋白脱色等特殊处理，操作过程简单。化学发光法也是通过直接测定血清中NO-2来反映血清NO浓度。
参考文献
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