关于HBV感染培养人胎肝细胞后差异应答基因的初步分离和鉴定

【摘要】 目的：建立培养人胎肝细胞感染HBV后差异应答基因的消减文库，并从中克隆鉴定出新的应答基因. 方法：分别从HBV感染及未感染的胎肝细胞中提取总RNA，用SMART PCR技术合成全长双链cDNA，经RsaⅠ酶切后将感染细胞的cDNA分为两组，分别衔接两个不同的接头，再与未感染细胞的cDNA进行两轮抑制性杂交及两轮抑制性PCR，将产物与T/A载体连接构建成消减cDNA文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，挑取克隆进行筛选排除假阳性，再行序列分析，鉴定胎肝细胞感染HBV后的差异应答基因. 结果：成功构建高效消减的HBV感染胎肝细胞cDNA文库，得到158个白色的克隆，随机选择了128个克隆经PCR扩增获得含有明确单一目的片断的克隆99个，长约100～400 bp，经筛选后得到70个克隆，测序表明有16个差异表达的基因，其中可能的新基因有5个. 结论：用抑制性消减杂交技术成功建立了HBV感染培养人胎肝细胞的消减cDNA文库，为进一步大规模筛选HBV感染后的应答基因奠定了基础，初步筛选出的新基因片断为进一步研究宫内感染的分子机制提供了依据.
【关键词】 HBV 胎肝细胞 杂交 消减文库 克隆
　　 0引言
　　慢性乙型肝炎易形成长期免疫耐受和复杂疾病谱，从HBsAg携带、慢性乙型肝炎到肝硬化、肝癌等，宿主对病毒的反应在发病机制中起重要作用. HBV与宿主相互作用不仅仅发生在细胞表面，很可能是一个非常复杂的相互作用网络，HBV与宿主组织细胞之间这种特定的相互作用决定着病毒的存活与疾病的发生、发展及转归，而这种相互作用反映在基因水平上则表现为病毒感染后宿主细胞基因表达谱的改变. 完整的HBV感染肝细胞基因表达谱的研究有可能使我们更深入地认识HBV的分子致病机制，从而发现更多、更有效的抗病毒作用靶标. 本研究我们用抑制性消减杂交技术克隆并鉴定HBV感染胎肝细胞后的应答基因，为阐明HBV宫内感染的分子机制奠定基础.
　　1材料和方法
　　1.1材料DMEM培养基购自Gibco公司， 胎牛血清购自Highclone公司，总RNA提取试剂盒购自Promega公司，SMART PCR cDNA合成试剂盒、 PCRSelect cDNA消减杂交试剂盒、Advantage2 cDNA PCR试剂盒、PCRSelect Differential Screening试剂盒、NucleoTrap PCR纯化试剂盒及尼龙膜、单面乳胶胶片均购自Clontech公司，［α32P］ dATP购自北京福瑞生物工程公司核酸研究室.
　　1.2方法
　　1.2.1HBV感染培养人胎肝细胞［1-2］用纤维连接素包被培养皿，将冻存的22 wk人胎肝细胞复苏，加入经过纯化的人血清来源的HBVDNA病毒，检测培养上清中HBcAg和细胞中HBV cccDNA同时阳性的胎肝细胞做为感染组，同时培养的未感染细胞做为阴性对照组，收集细胞进行后续的实验.
　　1.2.2抑制性消减杂交用总RNA提取试剂盒抽提两组细胞的总RNA，按说明书操作并进行定性定量分析. 用SMART PCR cDNA合成试剂盒合成长距离ds cDNA，按说明书操作，用CHROMA SPIN1000进行纯化，按说明书操作. 取36 μL Rsa I消化缓冲液和1.5 μL Rsa I酶（166.7 nkat）；混匀后于37℃孵育3 h. 以NucleoTrap PCR纯化试剂盒纯化消化后的cDNA样品，按说明书操作，经乙醇沉淀后，溶于6.7 μL双蒸水中，用紫外分光光度计定量，将浓度调节为300 mg/L. 以感染细胞为检测方，以未感染细胞为驱动方，加T4 DNA连接酶1 μL（6.66 μkat），分别与接头1和2连接，16 h反应过夜后进行接头连接效率检测. 在鉴定连接效率满意 （&>25%）后，将连接有接头1和2的检测方ds cDNA 1.5 μL分别与1.5 μL驱动方ds cDNA在68℃下杂交8 h后，立即将经过第一次消减杂交的两组体系混合，另加新变性的驱动方cDNA 1 μL，68℃杂交12 h，稀释（1∶200）. 取1 μL稀释后的第二次杂交后产物做模板，在50×advantage Taq聚合酶作用下，以接头1和2的外侧序列分别为5′及3′引物，进行第1次PCR扩增；取第一次PCR产物3 μL，10倍稀释后取1 μL做模板，以接头1和2内侧序列分别为5′及3′的巢式PCR引物，进行第二次PCR扩增，并进行PCR产物消减效率检测.
　　1.2.3cDNA消减文库的构建及PCR鉴定克隆取3 μL PCR产物及2 μL线性化质粒载体，在1 μL T4 DNA连接酶的作用下，14℃反应12 h后，-20℃保存. 取2 μL连接反应产物转染200 μL感受态大肠杆菌，225 r/min摇菌1.5 h，取200 μL菌液种植于含氨苄青霉素的LB/Xgal/IPTG培养板上，37℃培育18 h. 计数培养板中直径&>1 mm清晰的白色及蓝色菌落数. 随机挑取128个白色菌落于含氨苄青霉素的LB培养基中37℃摇菌过夜，取菌液1 μL做模板，以接头1和2内侧序列分别为5′及3′的PCR引物，进行PCR扩增，选取含有明确单一目的片断的克隆99个进行杂交筛选.
　　1.2.4斑点杂交法进行差异筛选取鉴定过的含有单一明确目的片断克隆的PCR反应液5 μL加5 μL 0.6 mol/L NaOH， 混匀变性； 取2 μL新鲜变性cDNA，分别点样于尼龙膜上；0.5 mol/L TrisCl（pH 7.6）中和，杂交炉中70℃烤膜2 h固定. 预杂交1 h后加入32P标记的4种探针：正向消减探针、检测相未消减探针、反向消减探针、驱动相未消减探针进行杂交过夜，加入探针的cpm值为107. 洗膜后进行放射自显影，选取差异表达的克隆. 用Ｍ（-20）引物测序，由北京鼎国公司代理.
　　2结果
　　2.1总RNA的定性定量分析紫外分光光度计检测检测相和驱动相胎肝细胞总RNA量分别为500和150 g/L，A260/280&>1.8，10 g/L琼脂糖凝胶电泳见RNA的28 S和18 S亚单位十分清晰，二者比例约为1.5∶1，证实RNA质优量足.
　　2.2SMART PCR合成长距离ds cDNA在10 g/L琼脂糖凝胶电泳上见ds cDNA为0.5～8.0 kb的弥漫性条带.
　　2.3Rsa I酶切可见ds cDNA由0.5～8.0 kb的弥漫性条带降解为约0.2～2.0 kb的条带（图1），证实酶切十分成功.
　　图1Ds cDNA样品经Rsa I消化前后20 g/L琼脂糖凝胶电泳
　　2.4Ds cDNA两端接头连接效率检测将连接有接头1和2的两组胎肝细胞ds cDNA分别用G3PDH 3′， 5′引物及以G3PDH 3′引物和接头上5′引物进行PCR扩增. 结果显示两组胎肝细胞接头连接效率均&>50%，即50%以上ds cDNA已与接头连接.
　　2.5两次抑制性PCR后的电泳两次抑制性PCR后分别取8 μL扩增产物在15 g/L琼脂糖凝胶电泳上可见正向和反向消减后的产物为约100～600 bp的弥漫性条带，而未消减前的产物为较大分子质量的弥漫性条带（图2）.
　　图2第2次PCR产物琼脂糖凝胶电泳
　　2.6cDNA消减文库消减效率鉴定消减后PCR产物中G3PDH在28个循环后可见弱的条带，而消减前G3PDH在18个循环后即可见明显条带（图3），说明所构建的消减文库具有很高的消减效率.
　　18， 23， 28， 32: PCR循环数.
　　图3扩增看家基因G3PDH检测消减效率凝胶电泳
　　2.7PCR鉴定克隆中插入的目的片断cDNA消减文库包含158个白色克隆，克隆饱满清晰. 随机挑取128个白色克隆，用巢式引物进行PCR扩增后，在20 g/L琼脂糖凝胶电泳上可见大小不等的插入片断，约100～400 bp.
　　2.8斑点杂交法进行差异筛选结果显示：正向杂交阳性而反向杂交为阴性或正向杂交信号比反向杂交高5倍以上的克隆有70个（图4）.
　　2.9克隆的序列分析经过差异筛选后的70个克隆测序表明插入cDNA片段大小为80～400 bp，部分基因为多拷贝，经GenBank (http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST)检索有11个cDNA片段和已知基因同源性为100%，其中6个功能已知，5个功能未知；5个cDNA片段和已知基因同源性为50%~84%，可能代表新基因(表1).
　　1~12， A~I: 样品序号.
　　图4斑点杂交筛选目的基因表1和已知基因完全同源的cDNA片段
　　3讨论
　　目前控制乙型肝炎流行的最主要手段是用乙型肝炎疫苗进行预防接种. 随着乙肝疫苗的普遍使用，乙型肝炎的水平传播已基本得到控制，而宫内感染，新生儿出生后用乙肝疫苗和特异性高效价免疫球蛋白不能阻断其传播，因而成为我们国家乙型肝炎传播的主要途径. 近几十年来，关于HBV宫内感染发生率的报道较多，然而对其具体机制研究较少［3-6］.

本研究选择胎肝细胞作为研究HBV宿主相互作用的模型，用抑制性消减杂交技术鉴定HBV感染胎肝细胞后的差异应答基因谱变化，经序列分析和同源性比较分析发现 HBV感染胎肝细胞的过程可能涉及到物质代谢和信号传导过程. 部分功能已知的差异应答基因包括编码合成甲氨酰磷酸合成酶1(CPS1)的基因，该酶参与催化尿素循环的起始步骤［7］；编码乳酸脱氢酶的基因，该酶为糖代谢不可缺少的酶类；编码CD59抗原的基因，CD59是一种广泛分布于组织细胞表面的GPI锚固糖蛋白，是一个重要的信号转导分子［8］；编码3甲基3羟基戊二酸辅酶A合成酶(HMGCoAs)的基因，该酶与胆固醇和酮体的代谢有关［9］；编码核受体结合蛋白(NRBP)的基因，NRBP参与调节细胞的信号传导通路及亚细胞内的运输［10-11］，据Chua等［12］报道，NRBP与登革热病毒的NS3蛋白相互作用而参与登革热病毒的致病过程. 还有5个和已知基因100%同源的cDNA片段功能未知；另有5个cDNA片段和已知基因同源性为50%~84%，可能代表新基因，我们正在进一步验证. 我们研究结果表明这些基因可能在HBV感染胎肝细胞的过程中构成一个相互作用的网络系统，但是他们的具体作用机制，仍需大量的实验证实，这也是我们今后要做的重点工作之一.

参考文献

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