第 1 章 引言
1.1 研究背景
水是生命之源，其包括河流、湖泊等表现形式。水生物安全已成为水质安全的基本需求，生物安全问题主要来源于病原微生物。由于分散点源的输入、合流制溢流污水的排放以及管网破损、错接等方面的原因，导致河流中存在大量的病原微生物，造成接触人群尤其是儿童、老年人和免疫系统脆弱者易患胃肠炎、呼吸道感染、眼睛或耳朵感染、皮疹等疾病。1988 年，上海爆发了世界上罕见的 30万人罹患甲肝事件，原因是患病者食用了遭到粪便污染沉积物中生长的毛蚶[1]。我国七大水系全部受到不同程度的病原微生物污染[2]。近年来，我国水体污染治理工作初见成效，以往河流黑臭、富营养化等水质问题逐渐得以解决，得益于我国发布的“水污染防治行动计划（简称水十条）”，可以预见人民对河流的认识由躲避转向可接触娱乐或食用水产品等。在表观清洁的水体里，人们难以直接感受到微生物污染的影响。我国农村水体污染物的来源主要包括畜禽养殖粪污水、水产养殖排水、农田排水、农村生活污水和村域地表径流 5 个方面[3]，其中养殖废水和生活污水中携带了大量粪便污染物，而粪便中含有大量的病原菌，人体可通过水体直接或间接与污染物接触，对人类健康产生严重的威胁[4]。人为因素的主观性和降雨模式有关的不确定性决定了污染源排放时间的随机性，土地利用类型的多样性和地形的复杂性使得非点源污染出现高度的空间异质性。现如今众多非点源污染研究主要集中在氮、磷类污染物，但对病原菌在地表水体中的污染及传播等研究了解甚少。经调查，我国每年有大量污废水未经处理就排入河道，其中工业废水和生活污水分别占 30%和 90%，污水中残留的抗生素可能诱导动物体内产生 ARGs，其粪便经排泄后，携带了 ARGs 的细菌进入周边环境。不可忽视的是 ARGs 不仅可导致化学污染，并且可通过可移动基因元件（MGEs）在细菌之间进行传播，由此以来 ARGs 的存在加重了病原菌在水生态系统中的污染风险，一旦感染致人类致病菌，将引起恶性公共健康安全事件的爆发[5, 6]。
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1.2 研究目的及意义
本文以北运河流域-典型村镇武清区大王庄村-人工湿地工程为逻辑开展工作，进行病原菌的污染特征诊断与控制技术研究，采用高通量定量PCR(HT-qPCR)技术，定量针对 37 种人类病原体的 69 个标记基因，11 个宿主的 42 个粪便标记物及 33 个 ARGs，以阐明北运河的病原体、ARGs 的时空分布特征，并进行微生物溯源技术（MST）以锁定病原微生物来源；同时以武清区大王庄村为代表，解析面源污染带来的病原微生物通量，并对人工湿地工程对病原菌的去除效果进行控制可行性评估。
在进行水质评价时，应从单纯的水化学指标标准转变为水安全综合评价标准，对流域生态系统的安全性和可持续性进行综合考虑。本文可在 TMDL 框架下完善溯源标记物的行为特征，为基于河道及地表水体粪便污染源的溯源技术提供理论依据，同时将修正病原菌污染来源的模式，对北运河水污染控制提供科学的数据和思路，为北运河流域水安全提供了保障，具有重要的科学意义和应用价值。
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第 2 章 国内外研究进展
2.1 河流水安全现状
水是生命之源，受到工业化及城市化和农业面源污染等影响，全球水资源短缺、水污染及生态环境等问题愈发严重，水安全成为我国污染防控工作关注的主要焦点，为推进国家水安全保障工作的落实，党的十八大以来，我国明确提出在新时期要以“节水优先、空间均衡、系统治理、两手发力”作为治水方针，构建可持续发展的水生态模式[8]。
水环境安全是构建综合水安全格局中的关键一环[9]，但众多相关研究者证实，受到病原菌污染影响，有 40%的河道尚未达到水环境质量标准[10]，众多水源传播疾病均是由病原微生物引起的，美国经过近 40 年水环境整治，现如今病原菌仍是污染河段首要的污染源，而病原菌污染问题一直以来是欧美地表水治理领域的难点，对水环境安全构成严重的威胁，被称为“21 世纪的挑战”[7]。美国加利福尼亚州报告了在 10 年间共造成 5000 余例感染事件均与水体中的病原菌有关[11]。我国七大水系全部受到不同程度的病原微生物污染[2]，大多数水域都存在粪大肠菌群污染状况严峻的形式[12]。王江权等人对海河流域典型河流中的微生物污染状况进行了评价，研究发现河流水体均受到了病原微生物的污染，其中以温榆河河段中肠球菌、大肠杆菌和粪大肠杆菌的污染水平最高且主要受到人类粪便的污染[13]。陈磊等人评估了北运河水系病原微生物的污染特征，研究表明病原微生物污染在丰水期表现出较高水平，且河道主要病原微生物来源为降雨径流引起的非点源污染[14]。孙文等人在研究中发现，北运河流域沙河水库的表层沉积物中芽孢杆菌的相对丰度较高，大肠杆菌、肠球菌和志贺氏菌在水平空间分布上存在较大差异，沉积物中的病原微生物丰度与氮磷和有机污染物浓度有直接相关关系[15]。
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2.2 病原微生物来源
点源污染和非点源污染是环境污染的两大污染来源。近年来，点源污染已得到有效控制，但由于径流造成的非点源污染难以管控，已成为水体污染的第三大污染源[16]。全球非点源污染的研究开始于上世纪 60 年代的发达国家，研究的内容主要包括污染物的监测、污染物负荷估算和污染物防治等方面[17]；研究方法主要包括人工原位实验和非点源模型模拟；研究的尺度可分为空间及时间两种维度，空间尺度包括小区、田间、区域、流域、国家和全球尺度；时间尺度包括小时、日、年和世纪尺度[18]。城市非点源污染是由于降雨冲刷作用将污染物经城市排水系统带入受纳水体，其污染负荷来源为大气干湿沉降、路面垃圾及建筑废料等[19]。农业非点源污染来源于农作残留物、生活垃圾、养殖废水等，经雨水冲刷作用溢流至地表水体，其具有分布面积广泛、污染物来源分散、复杂且随机、总量大、浓度低，难监测，难控制等特征[20]，养殖废水和生活污水中携带了大量粪便污染物，而粪便中含有大量的病原菌，人体可通过水体直接或间接与污染物接触，对人类健康产生严重的威胁。污水厂排放，雨水径流、沉积物和沉积物的重新悬浮也是影响地表水中病原菌浓度的重要因素[21]。
除此之外，ARGs 是驱动病原菌污染产生更高致病性风险的关键因素，污水中残留的抗生素可能诱导动物体内产生 ARGs，其粪便经排泄后，通过可移动基因元件（MGEs）在细菌之间进行传播，进而携带了 ARGs 的细菌进入周边环境，由此以来 ARGs 的存在加重了病原微生物在水生态系统中的污染风险[5]。中国在抗生素的使用和生产中名列前茅，每年近 162000 吨抗生素被人或动物消费[22]，ARGs 已被认为是新兴污染物[23]。制药厂、禽畜养殖场等污水排放是地表水环境中 ARGs 的主要来源[24]。这些带有 ARGs 的菌株可通过尿液、粪便等排泄物进入环境中，致使地表水体、土壤等成为 ARGs 的储存库。地表水体中常见的 ARGs有喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类、磺胺类、大环内酯类、氯霉素类、多药耐药类、β-内酰胺类等抗性基因[25]。刘晓慧等人研究了北京市医院废水、地下水及温榆河中抗生素和 ARGs 的污染情况，结果显示在医院的样品中喹诺酮类药物的浓度最高，在温榆河流域中磺酰胺抗性基因 sul1、sul2 和大环内酯类抗性基因ermB 的相对丰度最高[26]。姜欣书等人研究了中国典型农业污染河流中 ARGs 的污染状况。
图 3-1 北运河流域河道采样点分布图
第 3 章 北运河病原菌污染特征与源解析....................11
3.1 材料和方法 ............................11
3.1.1 水样采集、DNA 提取和水化学分析...................11
3.1.2 HT-qPCR 检测标记基因引物设计 ............................12
第 4 章 武清区典型村镇非点源污染分布特征..............................29
4.1 材料和方法 ...................................29
4.1.1 研究区概况 ............................29
4.1.2 采样点选择 ...................................31
第 5 章 坑塘—湿地工程对病原微生物的去除效果研究......................53
5.1 材料与方法 ............................53
5.1.1 工程概况 ...........................53
5.1.2 工程设计 ....................................54
第 5 章 坑塘—湿地工程对病原微生物的去除效果研究
5.1 材料与方法
5.1.1 工程概况
示范工程点位于天津市武清区大孟庄镇大王庄村，坑塘面积约 5000 平方米，现被村民用作养殖坑塘。坑塘周边土地利用类型有道路、农田和农村居民点。坑塘可通过小沟渠与农业沟渠连接，农业沟渠与北运河连接，坑塘与农业沟渠的连接渠的宽约 0.5m，长约 100m。降水情况下径流从坑塘与公路间斜坡可自然流入坑塘，农村居民点侧的坑塘设有多个进水口，农田侧从斜坡自然流入。坑塘旁有农村居民修建的简易厕所，下水直接排入坑塘。村内建有砖砌排水沟，排水沟周边设有多个汇水斜坡。对大王庄村坑塘的水位进行了长期监测，说明坑塘水量受到降雨的影响，变化非常明显，说明在降雨时有大量的地表径流流入坑塘，同时也说明坑塘作为受纳水体受到径流污染较大。坑塘的水质难以保证，不能满足人们的亲水要求。岸坡整治有待提升，不能满足坑塘的景观功能。
图 5-1 坑塘平均水位变化曲线
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结论
本研究北运河流域为例，利用 HT-qPCR 方法分析了北运河流域及其典型村镇大王庄村的病原菌、ARGs 和粪便污染及分布特征。考察了人工湿地对典型村镇的坑塘水体中污染物的去除效果。其主要结论如下：
（1）分析了北运河水体中人类病原体及 ARGs 时空分布特征，结果显示 41个病原体的标记基因中 16S rRNA a（芽孢杆菌）、和 gyrB（铜绿假单胞菌）的绝对丰度最高；除 mcr2外，其余26种ARGs 和3种MGEs的检出率均为 100%，ARGs 的丰度在上游表现为氨基糖苷类>磺胺类>多药耐药类，ARGs 的丰度在下游表现为氨基糖苷类>多药耐药类>磺胺类，aac3-Via 在研究区内相对丰度最高，在时间分布特征来看 ARGs 的丰度没有明显的异质性；人类、牛和猪的粪便为北运河主要污染源。部分人类致病菌在河道中感染风险较高，高于美国环保署关于娱乐水体感染的风险值。
（2）大王庄村的主要污染来源集中在养殖及生活污水的排放，致使村镇受到了一定程度的污染。芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、幽门螺杆菌的标记基因丰度较大，是风险较大的病原体；降雨径流中的总氮、总磷、COD、氨氮浓度均超过《地表水环境质量标准》（GB3838-2002）中的Ⅴ类水标准，非点源污染程度受到降雨量的影响，在所有土地利用类型中，降雨径流中污染物浓度随时间的变化表现出先升高再下降的趋势，其中悬浮物浓度在 15min 内削减率可达 89％；养殖区、公厕为重度污染区域，街道及沟渠为中度污染区域，居民院内较为清洁。各采样点均检测到了 ARGs，主要类型为氨基糖苷类、磺胺类、多药耐药类、链阳霉素B 类。大王庄村粪便污染来源较多，且分布范围广，主要粪便污染为人类、家禽和牛。由于降雨的影响，附着在颗粒物上病原体会随地表径流迁移，造成一定程度的非点源污染。
参考文献（略）